informacje



niedziela, 4 grudnia 2011

Szpinak w żyłach

Chciałbym zająć się tu drobną, ale mającą duże oddziaływanie sprawą, wynikłą po części ze zbytnich uproszczeń w mediach, a po części może ze sprytu specjalistów od marketingu, liczących na ludzką niewiedzę.

Ci, którzy spędzali dzieciństwo przed telewizorem nastawionym na takie kanały jak Carton Networks, przypomną sobie zapewne postać siłacza w marynarskim ubranku, znanym jako Peppeye, któremu duże dawki szpinaku pomagały rozprawić się z przeciwnościami losu. Wydaje się, że postać miała pierwotnie stanowić zachętę dla dzieci, aby zajadały się szpinakiem, będącym bardzo zdrowym dzięki dużej zawartości żelaza. Akurat z tym żelazem, okazało się że to nie prawda i nawet nie wiadomo kiedy i dlaczego ta błędna informacja zaczęła krążyć, ale szpinak rzeczywiście można dzieciom polecić, o ile oczywiście nie otrzymają go w postaci szaro-zielonej papki, która kilka miesięcy przeleżała w zamrażalniku ( warto zauważyć, że puszkowany szpinak Popeye'a jest wyraźnie szpinakiem liściastym, a taki jest podobno najsmaczniejszy). Sam niedawno odkryłem, że lekko podsmażone naleśniki ze szpinakiem, polane sosem czosnkowym, to danie nadzwyczaj smaczne i sycące. Zawiera różne witaminy, minerały i jest bardzo zielony.
Co z tego że zielony?

Moim zdaniem jest to głównie oznaka świeżości, ale co niektórzy przypisują jej znaczenie znacznie większe, bo oto barwiący liście chlorofil miałby mieć nadzwyczajne właściwości:
Tak, jak jakość benzyny poznajemy po wysokości liczby oktanów, tak jakość zielonego pokarmu określa ilość pigmentu chlorofilowego. Już w 1940 roku w czasopiśmie chirurgicznym "Journal of Surgery" pojawiła się informacja o 1200 chorych, u których chlorofil przyspieszył gojenie ran. Według Barbary Simonshon chlorofil zachowuje się jak kondensator energii słonecznej. Dr Swope mówi o nim, że "zieloną krew roślin zmienia w naszym organizmie na czerwoną". Dlaczego? Warto zwrócić uwagę na fakt, że hemoglobina - nasz barwnik krwi - ma podobną do chlorofilu strukturę chemiczną. Dzięki chlorofilowi rośliny żyją, a my oddychamy. Chlorofil poprawia obraz krwi, przyspiesza gojenie ran, poparzeń i chroni organizm przed stanami zapalnymi i infekcjami. Dzięki niemu transport tlenu jest lepszy, co zapobiega powstawaniu infekcji. Chlorofil w swej budowie jest podobny do hemoglobiny krwi : w hemoglobinie białkowa struktura formuje się wokół molekuły żelaza, w chlorofilu wokół magnezu. Dlatego właśnie chlorofil wpływa na organizm w ten sam sposób jak hemoglobina czyli podwyższa poziom tlenu.
Cały organizm zostaje dotleniony, w tym komórki mózgowe, co przekłada się na dobre samopoczucie i jasność myślenia.[1]
albo:
Dzięki chlorofilowi dostarczamy organizmowi niezbędne minerały, bez których nie da się żyć. Gdy jemy pokarm z zawartością chlorofilu, magnez jako jego główny element, dostaje się bezpośrednio do tkanki mięśniowej. Tam służy dobrej kondycji serca i układu oddechowego. Magnez jest właśnie tym pierwiastkiem, który rozpręża skurcze mięśni, uspakaja zakończenia nerwowe i usprawnia oddychanie. To też magnez jest jednym z ważniejszych minerałów. Podczas jego uwalniania z chlorofilu staje się mały cud. Chlorofil pochłania żelazo i zamienia się w ludzką krew.[2]
Gdyby było tak dobrze, to by było wspaniale, niestety dane naukowe na ten temat nie są jednoznaczne. Mało znalazłem prac na temat wchłaniania i biotransformacji chlorofilu w organizmach zwierzęcych. Gdyby chodziło o chlorofil w roślinach, to z samych abstraktów by się kilka tomów złożyło, jednak co do zwierząt miałem trudności. Na szczęście znalazłem wystarczająco aby sklecić artykuł i dojść do jakichś wniosków. Ale najpierw opowiem o naszym bohaterze:

Chlorofil to zielony barwnik roślinny, niezbędny do przeprowadzenia procesu fotosyntezy. Jego nazwa pochodzi od greckiego "chloros" czyli "zielony". Nie zawiera chloru. Właściwie w roślinach występują dwa jego rodzaje - chlorofil a i chlorofil b, różniące się podstawnikami pierścienia tetrapirolowego. Grupa ta jest heterocyklicznym pierścieniem o właściwościach aromatycznych, z czterema atomami azotu otaczającym wewnętrzny otwór. Podstawową formą, z której wywodzą się wszystkie inne, jest porfiryna:
Kropkami oznaczyłem pary elektronowe na atomach azotu. Mają one tutaj zasadnicze znaczenie, mogą bowiem uczestniczyć w tworzeniu wiązań koordynacyjnych, a zatem w tworzeniu kompleksów z kationami metalu. Cząsteczki zawierające pierścień w takiej właśnie formie, nazywany porfirynami, istnieją jednak jego różne pochodne, różniące się liczną i rozmieszczeniem wiązań podwójnych.
Związki zawierające taki pierścień spełniają wiele ważnych funkcji biologicznych. Przykładem witamina B 12, gdzie atomem skompleksowanym jest kobalt Co (III), pierścień przyjmuje w tym związku formę korynową, to jest pozbawioną czterech wiązań podwójnych w pięciokątnych członach pirolowych. W przypadku dwóch omawianych związków, w chlorofilu pierścień chlorynowy kompleksuje magnez, zaś w hemie w hemoglobinie pierścień porfirynowy kompleksuje żelazo II.

Związki tetrapirolowe dzięki obecności wielu skondensowanych wiązań podwójnych pochłaniają światło o różnych długościach fal. Dla chlorofilu jest to głównie światło czerwone i fioletowe, dlatego związek ma ciemnooliwkowy lub chłodny "morski" kolor. Aby rośliny mogły korzystać też z innych długości fali (dla światła słonecznego maksimum natężenia ma kolor zielony) wytwarzają barwniki o innych kolorach, głównie karotenoidy pochłaniające zieleń a więc czerwone. Mieszanka tych barwników decyduje o soczystym odcieniu liści roślin.
Gdy na chlorofil w chloroplastach pada światło, pierścień chlorynowy pochłania jego część. Wzbudzona w nim energia za pośrednictwem odpowiednich białek zostaje zamieniona na energię chemiczną przekazywaną w cząsteczkach ATP i NADPH. Roślina zużywa ją na przeprowadzanie skomplikowanych reakcji metabolicznych, zamieniających wodę, dwutlenek węgla i składniki mineralne, w cukry, białka, tłuszcze, drewno, jabłka i wszystko inne z czego roślina jest zbudowana. Nie będę tego szerzej omawiał, bo to rzecz dosyć skomplikowana.
Owo przeniesienie pochłoniętej energii na inne cząsteczki może jednak mieć również niekorzystne skutki. Przykładem jest choćby Hyperycyna, występująca naturalnie w Dziurawcu zwyczajnym. Przy dłuższym stosowaniu zioła może osiągnąć w skórze stężenie, powodujące po wystawieniu na słońce rumień i oparzenia. Następuje tutaj takie samo wzbudzanie cząsteczki, jednak energia wzbudzenia przekazywana jest nieprzygotowanym na to białkom, lipidom i związkom nukleinowym komórek skóry. Stąd zaleca się ostrożność przy korzystaniu ze specyfików zawierających to zioło. Inną przypadłością związaną z gromadzeniem się w organizmie porfiryn jest Porfiria, która oprócz zaburzeń układu nerwowego objawia się między innymi uczuleniem na światło. Skądinąd próbuje się wykorzystać tę właściwość w fotodynamicznym niszczeniu czerniaka

A co z barwnikiem krwi? W tym przypadku światło nie jest potrzebne do działania kompleksu, głównym bowiem czynnikiem decydującym o właściwościach biologicznych hemu jest nie zupełnie skompleksowane żelazo.
Już tu pisałem o kompleksach żelaza. W żelazocyjankach do jednego kationu żelaza podłączało się sześć grup cyjankowych. W przypadku hemu jeden atom żelaza jest zatrzymany przez cztery atomy azotu wewnątrz pierścienia, natomiast dwie strony pozostają wolne. Atom centralny może teraz utworzyć kompleksy z rozmaitymi ligandami nieorganicznymi, jak na przykład z cząsteczką tlenu, czemu sprzyja kształt przyłączonego białka globinowego. Hemoglobina zostaje zatem utlenowana ale nie utleniona. Zapominają o tym ci, którzy z przyczyn zdrowotnych zażywają bądź wstrzykują sobie takie "cudne" specyfiki, jak chloran potasu czy woda utleniona, twierdząc, że natleniają organizm. W takich przypadkach żelazo II utlenia się do żelaza III a takie nie ma zdolności do wiązania tlenu.

Tak więc w ogólnym zarysie hem w krwi ma coś wspólnego z chlorofilem roślin, jednak czy różnica polega tylko na rodzaju kompleksowanego metalu? Zobaczmy:

Pierścień jest, ale podoczepiane są do niego różne podstawniki. Pół biedy, gdy jak w przypadku chlorofilu, doczepiony jest długi łańcuch nienasyconego alkoholu, przez co związek staje się formalnie estrem - to można zhydrolizować i nie będzie sprawy; jednak inne podstawniki alkilowe są z nim połączone bezpośrednio, a to jest już trudniejsze do przekształcenia. Poza tym w chlorofilu mamy pierścień chlorynowy a w hemie porfirynowy - niby różnica dotyczy jednego wiązania mniej czy więcej, ale w chemii często tyle wystarczy abyśmy mieli do czynienia z całkiem innym związkiem.
Zresztą aby chlorofil zamienił się w hem, musi najpierw zostać wchłonięty, a żeby został wchłonięty, musi zostać spożyty. Niestety po spożyciu chlorofil ląduje w żołądku, którego silnie kwaśne środowisko odszczepia magnez zamieniając cząsteczkę w szarawą feofitynę. Jak wynika z badań na które się natknąłem, fityny są praktycznie jedynym wykrywalnym metabolitem chlorofilu w kale, co oznacza, że związek w całości ulega przemianie w formę bezmagnezową[3][5]. Wizja zielonego barwnika krążącego mam w żyłach i we właściwych miejscach zamieniającego się w potrzebne związki jest zatem błędna.

Czy wobec tego chlorofil może być dobrym dostarczycielem magnezu? Podobno minerały w chelatach wchłaniają się lepiej, a chelat to przecież taki właśnie kompleks.
Policzmy:
masa molowa chlorofilu a to 893.49 g/mol , dzienne zapotrzebowanie magnezu to ok 300-400 mg na dobę . Jedna cząsteczka chlorofilu zawiera jeden atom magnezu, więc mol cząsteczek zawiera 24 g magnezu. Robiąc z tego proporcję stwierdzamy, że dzienna dawka magnezu zawarta jest w ok. 14-15 gramach chlorofilu. Jak na czysty związek to ze dwie łyżki, co oczywiście nie zmieści się w jednej - dwóch kapsułkach. Szpinak zawiera 3 do 5% chlorofilu, więc na dzienną dawkę przypada około kilograma zieleniny. Raczej takie sobie to źródło, nawet przy założeniu 100% wchłaniania ( uwolniony magnez w rzeczywistości wchłania się słabo), choć oczywiście jakaś korzyść zawsze jest.

No dobrze. Chlorofil się nam demagnezuje, ale może owe fityny są wchłaniane? A owszem.
Znalazłem takie badanie, w którym szczurom podano feofitynę znakowaną węglem C-14, otrzymaną za pomocą preparatywnej chromatografii cienkowarstwowej wyciągu z liści tytoniu rosnącego na pożywkach wzbogaconych w ten izotop. Dlaczego akurat z tytoniu nie wiem, może dobrze się go stosuje do tych celów. W każdym razie po rozdziale i potwierdzeniu tożsamości związku, podano go szczurom po czym monitorowano radioaktywność wszystkich wydzielin. Okazało się, że część fityn pojawiła się we krwi, stanowiąc jednak około 1-2% całej podanej ilości. [4]

A co nasz organizm robi z fitynami? Trawi je. Może się to wydać nielogiczne, ale nie ma u nas mechanizmu recyklingu piroli ze zużytych krwinek. Organizm wydala je jak tylko może. Gdy czerwone krwinki obumrą wyłapuje je śledziona. Tam żelazo jest odszczepiane a enzymy rozrywają pierścień tworząc zieloną biliwerdynę, która po dalszych przekształceniach i wędrówce do wątroby zamienia się w żółtą bilirubinę, ta jest sprzęgana z kwasem glukuronowym i wydalana z żółcią do jelit gdzie bakterię przerabiają ją na sterkobilinogen, o barwie brązowej, stanowiący o kolorze kału. Na mniejszą skalę obserwujemy te przemiany w przypadku stłuczeń - najpierw wylana pod skórę krew zabarwia je na czerwono, potem na niebiesko aby przejść w zieleń i lekką żółć.
Cząsteczka feofityny różni się od hemu, jest jednak do niego na tyle podobna, że organizm będzie ją poddawał tym samym przemianom, więc z rozchodzenia się po organizmie nici. Nową porcję hemu wytworzy sobie w genialny sposób z prostych aminokwasów (a więc z białek). Zatem pomysł aby chlorofil zamieniał się w krew i natleniał organizm, wobec metabolizmu przepada z kretesem. Nie jest też tak, że chlorofil roślinny pochłonął tlen i będzie go nam oddawał, czy też że zastąpi hemoglobinę i sam będzie go przenosił do potrzebujących tkanek przy okazji zabijając wirusy i bakterie, jak sugeruje wiele stron. Nie do tego rośliny go wytarzają, żeby wiązał zupełnie im niepotrzebny tlen, on ma jedynie dostarczyć chemicznej energii po naświetleniu. Tej energii zresztą nie magazynuje, i nie będzie nam oddawał, nie jest więc "płynnym słońcem" jak piszą inne strony.

Kwestię natleniania organizmu chlorofilem podjął popularyzator nauki Ben Goldacre, a zrobił to w tak wspaniałym stylu, że warto go zacytować:
...pani doktor zalecała spożywanie szpinaku oraz ciemniejszych liści roślin, ponieważ zawierają więcej chlorofilu. Według pani McKeith jedzenie ich ma dobroczynne skutki, ponieważ "zawierają dużo tlenu" i naprawdę "natleniają Twoją krew". Ten sam nonsens powtarza się co rusz w jej książkach. (...) Czy chlorofil zawiera dużo tlenu? Nie. Pomaga wytwarzać tlen. Pod wpływem światła. A w twoich jelitach jest całkiem ciemno. Jeśli pojawia się tam światło, to oznacza to, że stało Ci się coś bardzo przykrego. Żaden chlorofil który zjesz, nie stworzy ci tam tlenu. A zresztą, nawet gdyby tak było, gdyby pani dr Gilian McKeith wsadziła ci latarkę do odbytu, próbując w ten sposób udowodnić, że ma rację, a zjedzona przez ciebie sałata zaczęłaby fotosyntezę, nawet jeśli napełniłaby twój brzuch dwutlenkiem węgla (podrzucając chloroplastom pożywkę), i jakimś cudem naprawdę doszłoby do produkcji tlenu, wciąż nie byłbyś w stanie przyswoić go sobie za pośrednictwem jelita, ponieważ narząd ten ma wchłaniać produkty spożywcze. To płuca są narządem zoptymalizowanym pod kątem wprowadzenia tlenu do organizmu. Nie masz chyba skrzeli w jelitach?
"Lekarze, Naukowcy, Szarlatani"s.125-126
Ostatnio pojawiła się jednak inna substancja, Chlorofilina, reklamowana jako wysoce skuteczna pochodna chlorofilu.
Jest to substancja sztuczna. Wyizolowany chlorofil poddany zmydlaniu, dzięki czemu odszczepia długołańcuchowy alkohol, i z magnezem zamienionym na miedź. Związek taki dobrze rozpuszcza się w wodzie i na oko bardzo mocno przypomina hem. Co ważniejsze, chlorofilina jest trwalsza w kwaśnym środowisku i duża jej część przedostaje się w niezmienionej postaci do jelit, gdzie mogłaby być wchłaniana. Zachowuje też kolor zielony, dlatego podobnie jak chlorofil jest dodawana do żywności jako barwnik E 141. Rozmaite strony zachwalają preparat, przypisując mu te same właściwości co chlorofilowi - a mianowicie ma ona, za pośrednictwem miedzi, przenosić tlen. Akurat co do tego mam spore wątpliwości.

W hemie mieliśmy żelazo II tworzące chętnie oktaedryczne kompleksy z sześcioma ligandami. Ponieważ cztery miejsca były zajęte przez azoty w pierścieniu porfirynowym, dwa pozostawały wolne i żelazo mogło przenosić tlen. Miedź również chętnie tworzy kompleksy, na przykład piękny, atramentowy kompleks z amoniakiem:
W tym przypadku liczba koordynacyjna wynosi 4. Jak łatwo się domyśleć, w porfirynie, wszystkie cztery miejsca na ligandy są dla atomu miedzi zajęte, więc tlen nie będzie miał gdzie się przyczepić.

No dobra, może nas nie natleni, ale czy przynosi nam jakieś korzyści? Żeby przynieść jakieś skutki musiałaby się wchłonąć. Barierę żołądka przechodzi i dostaje się do jelit, a jak wykazały badania, ulega wchłonięciu do krwi w zauważalnych ilościach. Oczywiście zrobiono takie badania i rzeczywiście wchłanianie miało miejsce. W jednym z nich, związanym z programem chemoprewencji na terenach silnie zanieczyszczonych, stwierdzono że po czterech miesiącach suplementacji 300 mg chlorofiliny dziennie, osiąga ona poziom 2,0 ug / ml osocza. Nie są to zatem duże ilości, jednak daje się je wykryć[5] Pytanie tylko, co z tego.
Chlorofilina jest nieco podobniejsza do hemu, ale się w niego nie zamienia. Badając przemiany podczas produkcji jedzenia, znaleziono i takie chlorofiliny, które miały za atom centralny żelazo. Ale nie były hemem.

No dobra. Pokrytykowałem już dosyć, czas abym zaczął chwalić (choć ostrożnie).

Jest korzyść z zażywania chlorofilu i pochodnych, na tyle istotna, że uzasadniałaby suplementację. Nie ma on jakichś nadzwyczajnych właściwości, ale może tworzyć związki kompleksowe z substancjami rakotwórczymi, to jest z nitrozoaminami, wielopierścieniowymi związkami aromatycznymi, mikotokynami i niektórymi dioksynami. Prawdopodobnie pomiędzy płaskimi cząsteczkami aromatycznymi zachodzi przeniesienie ładunku, do tworzy kompleksy typu EDA.
Przykładem jest badanie na mieszkańcach chińskiej prowincji Qidong, którzy bardzo często zapadają na raka wątroby, z powodu aflatoksyn zawartych w zapleśniałym jedzeniu. Podawanie chlorofiliny zredukowało wchłanianie toksyny o 55%[6]
Co ciekawe, podobne działanie wykazuje chlorofil, choć bowiem rozkłada się w żołądku, pochodna feofityna też może tworzyć takie kompleksy. Łącząc się z substancjami rakotwórczymi w przewodzie pokarmowym i hamując ich wchłanianie, zmniejsza zatem ryzyko raka w sytuacji ciągłego narażenia na takie substancje. Wydaje się jednak, że z uwagi na słabe wchłanianie nie ma większego znaczenia w procesach usuwania już wchłoniętych toksyn. Interesująca jest praca porównująca działanie ochronne chlorofilu i chlorofiliny na komórki wyściółki jelita pod wpływem wolnego hemu. Niektóre substancje i leki, np. luminal, mogą powodować rozpad czerwonych krwinek. Hem, uwolniony do osocza, działa toksycznie na wspomniane komórki. Chlorofil, a ściślej jego bezmagnezowe pochodne znacząco zmniejszają ten efekt, prawdopodobnie wiążąc hem kompleksem kanapkowym, natomiast chlorofilina miedziowa, nie wykazuje takiego działania[7]

Natknąłem się jeszcze na wzmianki o badaniach w których wykazano, że chlorofil hamuje wzrost komórek niektórych nowotworów, ale to były badania in vitro, na wyizolowanych komórkach traktowanych roztworem. Nie wiadomo czy w tych samych warunkach nie działałyby tak samo i na zdrowe, więc jak dla mnie to słaby dowód.[5]

Na koniec zajmę się jeszcze sprawą działania dezodoryzującego, które przypisuje się chlorofilowi. Właściwie nie znalazłem dobrego objaśnienia w jaki sposób miałby wpływać na zapach potu czy jamy ustnej, w sytuacji gdy jest on związany głównie nie z metabolizmem lecz z działalnością bakterii, które rozkładają składniki potu lub resztki jedzenia, tworząc nieprzyjemnie pachnące związki. Przez pierwszych kilka godzin pot jest praktycznie bezwonny. Ponieważ wchłanianie do organizmu jest niskie, raczej mało prawdopodobne aby mógł wydzielać się z potem w takich ilościach, aby na bieżąco kompleksować powstające związki.
Wiem natomiast o zastosowaniach do minimalizowania zapachu kału u chorych obłożnie, którzy załatwiają się do odpowiednich pojemników (wiem że kaczka jest na mocz, ale co jest na kał?).
Chlorofilina ma też zastosowanie w chorobie genetycznej trimetyloaminurii. Jest to jedna z chorób metabolicznych, polegająca na niedoborze enzymu rozkładającego trimetyloaminę - związek o rybim zapachu powstający z rozkładu białek. Odpowiada za woń nieświeżych ryb. U osób chorych na TMAU brak enzymu powoduje gromadzenie się aminy w organizmie, co powoduje okropną woń wydzielin, a więc moczu, kału, potu i śliny. Chlorofilina podawana doustnie może zminimalizować lub usunąć objawy, podobnie jak zażywanie węgla aktywnego[8], co wiąże się z wiązaniem TMA w przewodzie pokarmowym, gdzie powstaje jej najwięcej przy udziale bakterii jelitowych. Znalazłem jednak informację, że u niektórych chorych, suplementacja tym związkiem nie działa.
Uff!

Podsumowując:

Chlorofil cię nie natleni. Niestety nie zamieni się w krew, bo jego cząsteczka jest odmienna od hemu. Jest raczej kiepskim dostarczycielem magnezu. Może mieć natomiast znaczenie w profilaktyce zapobiegania nowotworom.

Tak więc być może puszka szpinaku nie pomoże wam w walce z przeciwnościami losu (chyba że to będzie ciężka puszka w skarpecie), ale trochę zieleniny raz na jakiś czas, nie zaszkodzi.

------
Źródła i przypisy:

[1] http://www.zielonazywnosc.pl/index.php?id_stranky=27
[2] http://www.cudownyportal.pl/article.php?article_id=1353

[3] Assessment of Degradation and Intestinal Cell Uptake of Carotenoids and Chlorophyll Derivatives from Spinach Puree Using an In Vitro Digestion and Caco-2 Human Cell Model, J. Agric. Food Chem.,
2001, 49 (4), pp 2082–2089
[4] Absorption of phytol from dietary chlorophyll in the rat, JOURNAL OF LIPID RESEARCH VOLUME 8. 1967
[5] Digestion, absorption, and cancer preventative activity of dietary chlorophyll derivatives, Nutrition Research, 27 (1), p.1-12, Jan 2007
[6] Chlorophyllin intervention reduces aflatoxin–DNA adducts in individuals at high risk for liver cancer, Proc Natl Acad Sci US A. 2001 December 4; 98 (25) : 14601–14606.
[7] Natural Chlorophyll but Not Chlorophyllin Prevents Heme-Induced Cytotoxic and Hyperproliferative Effects in Rat Colon, J.Nutr 135:1995-2000, August 2005
[8] Effects of the dietary supplements, activated charcoal and copper chlorophyllin, on urinary excretion of trimethylamine in Japanese trimethylaminuria patients., Life Sci. 2004 Apr 16;74(22):2739-47


Dłuższy przegląd badań na stronach Instytutu Linusa Paulinga

sobota, 26 listopada 2011

Ostatnio w... domu

Ponieważ na zajęciach z chromatografii jedna płytka pozostała niewykorzystana, postanowiłem ją wziąć i pobawić się w domu z markerami. Żeby jednak najpierw przetestować domową komorę z małej szklanki, naniosłem plamki flamastrów na pasek kredowego papieru wyciętego z notatnika i zawiesiłem w szklance, żeby się rozwijało. Nie mam w domu dobrych odczynników, więc eluentem była mieszanka spirytusu salicylowego i zmywacza do paznokci. Po dwóch godzinach rozwijania otrzymałem coś takiego:
Po lewej flamaster morski, po prawej brązowy. Zachęcony tym wynikiem, naniosłem flamastry na płytkę dodając po kropce czarnych długopisów. Rozwijanie trwało tylko pięć minut:Długopisy rozdzieliły się całkiem ładnie, natomiast flamastry prawie nie. Widocznie improwizowany sprzęt czasem sprawdza się lepiej od profesjonalnego.

środa, 9 listopada 2011

Stapianie z sodem

Dziś krótko o jednej z ważniejszych a przy tym ciekawszych prób analitycznych w chemii związków organicznych, mianowicie o wykrywaniu heteroatomów przez stapianie związków z metalicznym sodem.

Związki organiczne, jak wiadomo, są zasadniczo związkami węgla czterowartościowego, często połączonego w łańcuch, z wodorem, tlenem i innymi pierwiastkami zależnie od posiadanych grup funkcyjnych i podstawników. Aby przynajmniej orientacyjnie stwierdzić, czy nie mamy tu do czynienia z takim właśnie przypadkiem, należy sprawdzić zawartość tych innych pierwiastków. Nie można tego zrobić bezpośrednio działając na substancję odczynnikami (to znaczy czasem można, ale nie z każdym związkiem się to udaje), najpierw więc należy ją rozłożyć, zaś zawarte pierwiastki przekształcić w łatwo wykrywalne związki nieorganiczne. Właśnie dlatego przeprowadzamy stapianie z metalicznym sodem( tzw. próba Lassaigne'a).
Kawałki sodu

Należy wziąć małą próbóweczkę i umieścić w niej niewielką (0,2 g lub 0,2 ml) ilość badanej substancji. Następnie wziąć kawałeczek metalicznego sodu mniej więcej wielkości ziarnka grochu, wcześniej odsączonego od resztek nafty czy oleju w których musiał być przechowywany z racji dużej reaktywności metalu, wrzucić do próbki substancji i ująwszy metalowymi szczypcami ostrożnie ogrzewać.
Stapia się

Sód powinien się stopić i zacząć dosyć gwałtownie reagować z naszą próbką, iskrząc i wydzielając dym. Może się też zdarzyć, że pary naszego związku zapalą się, dlatego całość wykonujemy pod wyciągiem, najlepiej w okularach ochronnych, pamiętając przy tym, aby wylot próbówki był skierowany do wnętrza dygestorium nie zaś na salę.
Gdy stop we wnętrzu przereaguje należy ogrzać całość mocniej, aż szkło rozgrzeje się do czerwoności. Czy nie pęknie? Właśnie że ma pęknąć.

Rozgrzaną do czerwoności próbówkę szybkim ruchem wprowadzany do uprzednio przygotowanej parowniczki z woda, w miarę możliwości pukając o nią dnem. Naczynie pęknie zaś stop zetknie się z wodą i gwałtownej reakcji ulegną resztki pozostałego jeszcze sodu. Rzecz najlepiej objaśni film wykonany pod czas tych czynności, co przysporzyło mi niemało trudności:



Jak widać substancja uległa zwęgleniu, jednak nie cały sód przereagował. Gdy próbówka pękła w wodzie, część zapalonego sodu pyprysnęła, co potwierdza zasadność prowadzenia reakcji pod wyciągiem. Skądinąd dobrze, że iskra nie trafiła w miseczkę z resztkami i papierkami do odsączenia nafty, boby się zrobił mały pożar.
Teraz należy tylko przesączyć zawartość parowniczki i tak otrzymany płyn poddać próbom analitycznym.

Azot zawarty w związkach (np. grupy aminowe, amidowe, azotanowe, nitrozowe itd.) ulega przemianie w cyjanek, który wykrywa się przy pomocy soli żelaza II, co już opisywałem w notce o błękicie pruskim. Siarka, na przykład z grup sulfonowych czy tiolowych, zamieni się w siarczki. Jeśli w związku zawarta była i siarka i azot, powstają jony tiocyjanianowe (rodanki), wykrywane żelazem III. Halogeny zamieniają się w odpowiednie chlorki, jodki i bromki.
Nie wiem jak jest z innymi, rzadszymi pierwiastkami. Podejrzewam, że fosfor zamienia się w fosforek sodu, który w wodzie daje gazowy fosfan, przez co w roztworze już się go nie wykryje.

------
Ps. - gdzieś tak w połowie listopada będę brał w kolejnej konferencji studenckiej, gdzie wygłoszę arcyciekawy jak mam nadzieję, referat o rodnikowej dekarboksylacji benzoesanu sodu w napojach, prowadzącej do powstawania rakotwórczego benzenu. Na razie więc trzymajcie kciuki, a potem dodam tu o tym dłuższy artykuł, który może uda się puścić w ramach Research Bloggingu

wtorek, 1 listopada 2011

Chromatograficzna analiza barwników roślinnych



Jesień... jesień... lecą liście z drzew...

Jesień

Jesienią dotychczas jednorodnie zielone, kolorystycznie jednolite rośliny, nagle przebarwiają się całą paletą żółci, pomarańczy, czerwieni i brązów, gdy zaś w dodatku pogoda jest słoneczna krajobraz może wyglądać równie zachwycająco jak w pełnym rozkwicie letnich miesięcy. Chemik natomiast, oprócz walorów całkiem estetycznych, dostrzeże wokół barwniki, dotychczas maskowane przez głęboką zieleń chlorofilu, teraz zaś, po jego rozpadzie, ujawniające się w całej okazałości. Wszystkie te ksantofile, luteiny, karotenoidy...

Taki też surowiec roślinny miał stanowić obiekt mojej następnej analizy na zajęciach z chromatografii, zanim jednak opowiem o tym jak mi się to robiło i co w jej wyniku otrzymałem, przejdę przez niezbędną, dłuższą dygresję historyczno-naukową:

Chromatografia to w najogólniejszym ujęciu, metoda rozdzielania mieszanin różnych związków, wykorzystująca różnice w oddziaływaniu tychże z układem dwóch faz. Od tego jakie będą to fazy zależy rodzaj techniki. Również oddziaływania mogą mieć najrozmaitszą postać, począwszy od czynników czysto mechanicznych, przez własności do ad i absorbowania się w pewnych ciałach aż po zdolność do tworzenia mniej lub bardziej trwałych związków chemicznych. Współcześnie jest to jedna z najważniejszych technik analitycznych, mająca zastosowanie w przeważającej części wykonywanych badań. A wszystko zaczęło się pewnego dnia, gdy pewien botanik...

Około roku 1901 rosyjski botanik Michaił Cwiet zatrudniony na rosyjskim wówczas uniwersytecie warszawskim, trudnił się badaniami nad właściwościami wyciągów roślinnych. Wiadomo było, że w liściach zawarte są różne substancje barwne, istniał jednak problem w odpowiednim ich rozdziale. Ponadto zastanawiającą sprawą było to jak różne rozpuszczalniki ekstrahują z roślin poszczególne składniki. Jedne, jak alkohol i eter, dawały ciemnozielone roztwory zawierające głównie chlorofil, płynne węglowodory dawały wyciągi żółtawo zielone natomiast eter naftowy i benzyna zupełnie żółte. Ponieważ w tym czasie struktura chemiczna barwników roślinnych nie była jeszcze znana, tak różna zdolność ekstrakcyjna dobrych rozpuszczalników była trudna do wyjaśnienia.
Cwiet postanowił sprawdzić, czy jest to związane wyłącznie z właściwościami barwników czy też z własnościami tkanki roślinnej. Zastanawiał się:
Jeśli chlorofil jest całkowicie rozpuszczalny w eterze naftowym, jak to się powszechnie uznaje, to dlaczego nie został usunięty ze świeżych i suchych liści w tym rozpuszczalniku? Dlaczego rozpuszcza się tylko żółty składnik?[1]

Za materiał posłużyły mu liście babki i jasnoty. Po ugnieceniu w moździerzu na papkę i zalaniu ich mieszaniną eteru naftowego i alkoholu, dla ekstrakcji wszystkich składników, w otrzymanym roztworze moczył przez pewien czas paski papieru i odparował rozpuszczalniki pod próżnią. Włóknista struktura papieru miała udawać strukturę tkanki roślinnej. Gdy teraz powtarzał eksperymenty z tak zabarwionymi paskami papieru, wszystkie zaobserwowane wcześniej prawidłowości się powtarzały - alkohol wymywał chlorofil a benzyna karoteny. Cwiet uznał zatem, że obserwowane efekty mają związek z siłą adsorpcji barwników do tkanek roślinnych. Alkohol mógł przezwyciężyć powinowactwo dla chlorofilu, natomiast rozpuszczalniki alifatyczne nie, jeśli jednak chlorofil został wyodrębniony przez wygotowanie z części roślinnych, to tak uzyskany pigment łatwo rozpuszczał się w eterze naftowym. Gdy zaś do takiego roztworu dodano bibuły, zielony barwnik został całkowicie pochłonięty (zaadsorbowany) przez papier i oddzielony od żółtawego roztworu.

W dalszych doświadczeniach stwierdził, że zdolność do adsorbowania chlorofilu z roztworów benzynowych i naftowych mają praktycznie wszystkie stałe substancje nierozpuszczalne w tych cieczach. Przetestował pod tym kątem pierwiastki, ich tlenki, chlorki, siarczany, węglany, krzemiany, stałe kwasy organiczne, cukry, białka a nawet ziemię okrzemkową i mączkę kostną - za każdym razem uzyskując taki sam rezultat. Tak więc sprawa rozpuszczalności i powinowactwa barwników w roślinach została wyjaśniona. Cwiet jednak rozwijał temat dalej, zastanawiając się nad możliwością wykorzystania zauważonych prawidłowości w analityce.

Wyekstrahowaną mieszaninę barwników mieszał z absorbentem, którym był węglan wapnia, oddzielając chlorofil i uzyskując roztwór karotenów. Tak uzyskany osad przemywał mieszaniną nafty z alkoholem uzyskując pięknie zielony roztwór z którego metodami ekstrakcyjnymi oddzielał od chlorofilu ksantofile. Zauważył przy tym, że gdy absorbent z pochłoniętym barwnikiem o mniejszym powinowactwie przemywano roztworem barwnika mającym większe powinowactwo, ten słabszy był wypierany. Istniał wyraźny szereg kolejności wypierania jednych substancji przez drugie. Co z tego wynikało?

Gdy Cwiet wlał ekstrakt wszystkich składników na szczyt kolumny, to jest szklanej rurki wypełnionej ubitym węglanem, i przemywał całość rozpuszczalnikiem, substancje ułożyły się w rurce w oddzielne prążki zgodnie z szeregiem adsorpcji/wypierania. Barwnik najsłabiej pochłaniany, wypierany z adsorbenta przez wszystkie inne składniki, tworzył pierwszy prążek, za nim pojawiał się barwnik który go wypierał a sam był wypierany przez pozostałe. Rozdział ten był zupełny i pozwalał chemikowi na oddzielenie jednego składnika od wszystkich innych; wystarczyło po prostu podstawić w odpowiednim momencie zlewkę pod kurek wylotu i odlać roztwór tej konkretnej substancji, bez konieczności tych wszystkich ekstrakcji, wytrząsań i odparowań. Badacz porównał to do tęczy, w której oddzielone zostają od siebie poszczególne kolory. Dlatego też w pierwszej pracy z 1906 roku nazwał tą technikę Chromatografią - co dosłownie znaczy tyle, co "pisanie kolorem". Co ciekawsze jego nazwisko "cwiet" w języku rosyjskim znaczy tyle co "kolor".

W toku dalszych prac odkrył, że chlorofil jest w rzeczywistości mieszaniną dwóch substancji - jasno i ciemnozielonej, które nazwał chlorofilem α i chlorofilem β. W podobny sposób rozróżnił ksantofile i karoteny.

Piękne odkrycie, jednak Cwiet został na długi czas zapomniany. Niestety większość prac na ten temat została opublikowana w języku rosyjskim, tym samym nie były powszechnie znane w świecie naukowym. Jedyni dwaj naukowcy, który próbowali powtórzyć doświadczenie, użyli zbyt agresywnego rozpuszczalnika, który odbarwiał im chlorofil. Po takiej negatywnej weryfikacji pomysły botanika uznano za wymysły. Zmarł w 1930 roku osiągając uznanie jedynie w kwestiach botanicznych.

W międzyczasie inny badacze wpadali na zbliżone pomysły. W 1860 roku Christian Friedrich Schönbein zauważył, że roztwory różnych barwników wsiąkają w papier z różną prędkością. Jeśli więc wsadzić pasek bibuły w roztwór pomieszanych barwników, ten szybszy odrobinę przeganiał wolniejszy i dawało się zauważyć różnicę. Metodą była stosowana głównie do zbadania czystości związków oraz potwierdzania składu mieszanin. Schönbein sądził, że rzecz polega na różnej prędkości przeciskania się cząsteczek barwników przez kapilary między włóknami, dlatego nazwał swą metodę analizą kapilarną. Miało to wówczas całkiem przyzwoite podstawy, wszak prędkość z jaką gazy przedostają się przez przegrody ceramiczne wprost zależy od ich masy cząsteczkowej. Gdyby badacz zamiast rozpuszczać związki w rozpuszczalniku, naniósł je na początek wstęgi papierowej i zanurzył ją w czystym rozpuszczalniku, to byłaby to chromatografia bibułowa. Jednak do tego etapu nie dotarł, zaś jego metoda miała niską przydatność w badaniach analitycznych. Już pod koniec XIX wieku próbowano oddzielać lżejsze i cięższe frakcje ropy naftowej, przepuszczając ją przez rurę wypełnioną ziemią okrzemkową - chciano tu skorzystać z tej samej zasady, bez świadomości na czym na prawdę polega proces.

Trzeba było czekać ponad 20 lat nim ktoś, kto miał ku temu poważny powód, przypomniał sobie i pracach rosyjskiego botanika.

Karotenoidy były dobrze znane już w XIX wieku, gdy wyizolowano je z roślin. W latach 20. minionego wieku zauważono powiązanie pomiędzy nimi a witaminą A, nie było jednak wiadome czy to karoten zamienia się w witaminę, czy odwrotnie. W tym okresie związkiem tym zainteresował się niemiecki chemik Richard Kuhn. Fascynowała go regularna, symetryczna struktura polienów - związków zawierających łańcuchy z naprzemiennych wiązań pojedynczych i podwójnych - dlatego izolował i badał podobne związki, wykazując istotną zależność między budową a żywą barwą. Tymczasem jego konkurent Paul Karrer przedstawił swoją propozycję składu i budowy karotenu. Była to propozycja logiczna, oparta na doświadczeniach, jednak jeden ze współpracowników Kuhna, Edgard Lederer, badając naturalny związek otrzymał odmienne wyniki. Kuhn zinterpretował tą rozbieżność poprawnie - uznał, że skoro struktura teoretyczna jest poprawna, a wyniki badań praktycznych odmienne, to naturalny karoten jest mieszaniną różnych związków o podobnych właściwościach, zaś struktura Karrera należy do jednego z nich. Teraz należało je rozdzielić.

Kuhn musiał się w swojej pracy nad izolowaniem naturalnych związków natknąć na prace Cwieta, dlatego zaproponował współpracownikowi aby spróbował chromatografii. Po wielu próbach dobierania rozpuszczalników i adsorbentów udało mu się oczyścić, oddzielić i skoncentrować dwie odmiany karotenu, określone jako karoten alfa i beta. W późniejszym okresie wykryli jeszcze karoten gamma. Odmiany różniły się postacią krystaliczną i właściwościami optycznymi. Ich praca opisująca ten rozdział - a tym samym i chromatografię - ukazała się w 1931 roku.
Struktura zaproponowana przez Karrera odpowiadała odmianie beta, będącej najczęstszą w roślinach zielonych, natomiast odmiana alfa w dużej ilości występuje w marchwi. Kuhn w dalszych badaniach skupił się na procesach przemiany karotenu w witaminę A, na jej działaniu na zdrowie, przemianach metabolicznych itd. Ostatecznie w 1938 roku za badania nad karotenami i witaminami otrzymał Nagrodę Nobla z chemii. Wspomniany Karrer który zsyntetyzował swój karoten a także wiele innych witamin ( w tym wit. B wraz z Kuhnem) i zbadał ich struktury, otrzymał tę nagrodę rok wcześniej, w 1937.
Beta karoten
W latach 30. techniki chromatograficzne z wolna zaczęły przedostawać się do nurtu analityki chemicznej, jednak dopiero rozwój nowych technik uczynił je przydatnymi. W 1938 roku brytyjski chemik Archer Martin zajmujący się dotychczas wyodrębnianiem i oczyszczaniem witaminy E, zaczął wraz z Richardem Synge zajmować się metodami rozdziału aminokwasów ze zhydrolizowanej wełny.
Sam wcześniej specjalizował się w ekstrakcji w przeciwprądzie. Przepuszczał niemieszające się ciecze przez rurę w ten sposób, że jedna przepływała w jedną stronę a druga w drugą, co było najefektywniejszym sposobem. Podobną metodę chciał stosować w tym przypadku, jednak okazała bardzo kłopotliwa - dla dobrzej ekstrakcji należało użyć baterii 45 ekstraktorów które trzeba było pilnować cały dzień. Badacze postanowili więc połączyć chromatografię z ekstrakcją, przy czym aparatura miała być tak skonstruowana aby uzyskać przeciwprąd. Napełnili rurę mieszaniną wełny i bawełny tak, że poszczególne włókna skupiały się w pęczki na końcach kolumny. Bawełna łatwo nasiąkała wodnym roztworem aminokwasów zaś wełna chętniej nasiąkała chloroformem, wystarczyło więc włożyć pęczki z dwóch stron w różne naczynia aby uzyskać przeciwne biegi cieczy. Jednak pierwsze próby pokazały, że rozdział jest jeszcze gorszy . Martin pomyślał wówczas, że jeśli dwie fazy ruchome nie zdają egzaminu, to powinien spróbować z jedną.

Kolumna szklana została wypełniona żelem krzemionkowym, używanym do osuszania substancji. Dobrze wiązał on wodę i był nią dobrze zwilżany, więc po nasączeniu roztworem wodnym był nim nasiąknięty i zatrzymywał go w jednym miejscu. Gdy przez kolumnę przelewano chloroform aminokwasy ekstrahowały do niego, ponieważ zaś współczynnik podziału (to jest stopień przejścia z jednej cieczy do drugiej) był dla nich różny, jedne robiły to bardziej inne zaś mniej. Przy ciągłym przesączaniu chloroformu dawało to w efekcie prążki poszczególnych substancji, co udowodniły próby z oranżem metylowym[2]. Była to zatem chromatografia kolumnowa, taka jak u Cwieta, lecz zasada rozdziału substancji opierała się na zupełnie innym zjawisku, na podziale między dwie niemieszające się ciecze - dlatego nazwano ją Chromatografią podziałową.

Metoda okazała się dobra dla rozdziału wielu innych substancji, dlatego za tych kilka prac na ten temat z 1941 roku, obaj naukowcy dostali Nagrodę Nobla z Chemii w roku 1952. Co ciekawsze już w tych pierwszych pracach opisali możliwość podobnego rozdziału w którym fazą ruchomą jest gaz. I rzeczywiście, już w połowie lat 40. udało się rozdzielić mieszaninę tlenu i tlenku węgla. Inne techniki są bardzo liczne, ale wymienić można chromatografię papierową, wykonywaną na papierowej wstędze i chromatografię cienkowarstwową, wykonywaną na płytkach pokrytych cieniutką warstwą adsorbenta - i taką właśnie analizę wykonywałem na zajęciach.

Wszystkie te metody nie były by jednak wiele warte w analizie, gdyby nie pewna ich specyficzna własność - dla danej temperatury, rodzaju wypełnienia i eluenta, czas po jakim substancja przejdzie przez złoże (czas retencji) jest charakterystyczny tylko dla niej. Jeśli więc na końcu kolumny umieścimy detektor, który pokaże nam, że oto w rozpuszczalniku pojawiła się jakaś substancja, jeśli będziemy znali wszystkie parametry i będziemy wiedzieli jakiego rodzaju mieszaninę wprowadziliśmy na początku, to będziemy mogli poznać jakie substancje zostały wykryte w detektorze, zaś natężenie sygnału powiadomi nas o całkowitej ilości.
Możemy na początku kolumny umieścić ścieki, a po skończonej analizie otrzymamy wykres z pikami odpowiadającymi 20-30 substancjom, jakie były zawarte w mieszaninie, i każdą możemy oznaczyć jakościowo i ilościowo. Właśnie dlatego chemicy analitycy wpadli w zachwyt, gdy techniki chromatograficzne zostały wprowadzone do użytku.
Przykładowy chromatogram wykreślony przez detektor


Moją analizę, jak wspomniałem, przeprowadzałem na płytce, w cienkiej warstwie absorbenta, którym był w tym przypadku wysuszony żel krzemionkowy. Próbka badana ma zatem postać kilku kropel nanoszonych na zaznaczaną linię w pobliżu jednej z krawędzi płytki. Wkłada się ją do zamkniętego szklanego naczynia, na którego dno wlano wcześniej przygotowany eluent. Dobrze jest, gdy takie naczynie pozostanie zamknięte przed rozdziałem przez pewien czas, aby powietrze wewnątrz nasyciło się parami rozpuszczalnika. Często obok próbki badanej nakrapla się roztwór wzorca, zawierający jedną lub kilka znanych substancji. Przez porównywanie chromatogramów tych dwóch mieszanin można z dużą pewnością potwierdzić obecność w próbce substancji zawartych we wzorcu. Następnie płytkę wsadza się do komory, tak aby krawędź tylko lekko zanurzyła się w rozpuszczalniku. Zaczyna on teraz podsiąkać w górę płytki, porywając za sobą naniesione substancje, które zgodnie z powinowactwem do adsorbenta rozdzielają się na prążki. Rozwijania chromatogramu nie przeprowadza się do końca. Gdy czoło rozpuszczalnika mocno zbliży się do drugiego brzegu płytki, wyciągamy ją, zaznaczamy dokąd sięgnął płyn i suszymy.

Jak jednak wspomniany czas przechodzenia przez złoże ma się do położenia plamek? Przecież skoro nawet eluent nie dociera do brzegu płytki, to również rozdzielane substancje nie przejdą przez złoże a my nie zmierzymy czasu ich przechodzenia. No i otóż w przypadku tej techniki stosuje się inną metodę, mianowicie wyznacza się współczynnik Rf (retardation factor). Po prostu całkowitą długość drogi przebytą przez daną substancję dzieli się przez całkowitą długość drogi przebytą przez rozpuszczalnik (dlatego zaznaczamy punkty początku i końca) i uzyskujemy pewną wartość mniejszą od jedności (czasem dla wygody używa się jej stokrotności). Nazywany tą wartość współczynnikiem opóźnienia.

Tak więc najpierw należało zebrać materiał. Wybrałem liście ligustru z którego często tworzy się żywopłoty, są bowiem skórzaste, nieco grubsze i ciemnozielone. Dla urozmaicenia zerwałem też kilka czerwonych liści sumaka, mając nadzieję, że wygląd chromatogramu będzie przez to ciekawszy. Po rozdrobnieniu liście wsypałem do porcelanowego moździerza i utłukłem na miazgę.

W moździerzu

Następnie zalałem heksanem, dla ekstrakcji barwników. Jednak roztwór heksanowy był bardzo słabo zabarwiony - co skądinąd potwierdzało obserwacje Cwieta. Heksan jest głównym składnikiem eteru naftowego. Dolałem więc równoważną ilość metanolu i teraz roztwór stał się intensywnie zielony. Powstałą rzadką papkę należało teraz przesączyć. Gdy to robiłem zwróciłem uwagę na ładny wygląd zazielenionego sączka:
Sączyło się
Otrzymany przesącz rozdzielił mi się na dwie warstwy - metanolowo-wodną o pomarańczowym kolorze i heksanową ciemno zieloną. Woda pochodziła oczywiście z liści. Nie rozdzielałem ich jednak i przy pobieraniu próbek starałem się brać zarówno z warstwy zielonej jak i pomarańczowej.
Warstwy
Teraz należało przygotować komorę. Było to prostopadłościenne naczynie z wewnętrznymi przegródkami, zamykane szkiełkiem. Na dno wlałem kilka centymetrów sześciennych mieszaniny heksanu z acetonem w stosunku 4:1 i całość zamknąłem przykrywką.
Wyciąłem z większego arkusza płytkę tak, aby mieściła się w komorze. Płytka miała postać arkusza folii aluminiowej z naniesioną z jednej strony białą warstwą krzemionki, w dotyku przypominającą mocno nakredowany papier. U dołu, pół centymetra od krawędzi, lekko aby nie zadrapać pokrycia, narysowałem ołówkiem linię i oznaczyłem literami miejsca naniesienia próbek. Przy pomocy kapilarki naniosłem po kilka kropel na każde z trzech miejsc - w jednym tylko mój ekstrakt, w drugim ekstrakt zmieszany ze wzorcem karotenów a na trzecie sam wzorzec:
Naniesione próbki
Wzorzec zawierał karoten. Przy rozwijaniu na tej samej płytce miał dawać żółtą plamkę. Wystarczyło zatem później porównać i już wiedzieć, że "aha, w chromatogramie próbki jest żółta plamka na tej samej wysokości - czyli, że karoten jest".
No dobra - komora przygotowana i nasycona, płytka oznaczona, próbki naniesione. I co teraz?
A no wrzuciłem płytkę do komory, krawędź zanurzyła się lekko w eluencie, ten zaczął podsiąkać w górę a gdy dotarł do plamek, porwał je ze sobą. Jednak wkrótce jednolite plamki zaczęły się rozdzielać i zamieniły się w osobne pasma. Zresztą, co tu dłużej opisywać, zobaczcie animację którą skleiłem z kilkunastu zdjęć komory:



Jako podkład muzyczny wykorzystałem fragment "Wiosny" Vivaldiego, jako że w końcu to roślinne barwniki są tu rozdzielane.

Gdy rozpuszczalnik zbliżył się do drugiego brzegu płytki, wyjąłem ją, zaznaczyłem dokąd dotarł i szybko wysuszyłem. Mieszanina rozdzieliła się na 8-9 barwnych pasm, zgodnie ze wzrastającą niepolarnością (a co za tym idzie spadającym powinowactwem do podłoża). Na podstawie porównywania wyniku z innymi dostępnymi w internecie mogę powiedzieć, że dwa pierwsze pasma to któreś z ksantofili, dwa następne, o kolorze ciepłej i chłodnej zieleni, to chlorofil β i chlorofil α, szare pasmo to feofityna , czyli chlorofil pozbawiony magnezu, na samym zaś końcu łatwo można zidentyfikować karoten.

Drugie rozwijanie mieliśmy przeprowadzać w innym, wybranym przez siebie składzie eluenta, mając więc na uwadze, że większość pasm do końca rozwijania nie przekroczyła połowy, postanowiłem pchnąć je do przodu, zwiększając polarność rozpuszczalnika.

Drugi raz zatem rozdział był dokonany z mieszaniną heksanu i metanolu w stosunku 1:1. I tutaj najlepiej rzecz zobrazuje odpowiednia animacja:




Tym razem uznałem, że najodpowiedniejszym podkładem będzie ten fragment Fantazji Chromatycznej Bacha, nie tylko dlatego, że tytuł mi pasował, ale też dlatego, że to ładny fragment.

Pasma rzeczywiście poszły do przodu, aż za bardzo i w efekcie zaczęły się na siebie nakładać. Zagadką jest dla mnie pojawienie się wyraźnego pasma luteiny - żółtawego barwnika liści. Wcześniej go nie było albo nakładało się na któryś z chlorofili.

Teraz należało poobliczać Rf-y dla poszczególnych plamek, objaśnić co i jak zachodziło i sklecić sprawozdanie, czego bardzo nie lubię. Bo tak, to mógłbym robić, i robić...



Za jakiś czas opowiem nieco więcej o chromatografii i jej technikach. Może uda się też wreszcie pododawać inne filmiki które wykonałem na zajęciach - te ze stapianiem substancji z metalicznym sodem są bardzo efektowne.


-----
[1] M. Tsweet Physical chemical studies on chlorophyll adsorptions ,Berichte der Deutschen botanischen Gesellschaft 24 , 316-23 (1906) - w tłumaczeniu na język angielski przez Henry'ego M. Leicestera, w: Source Book in chemistry 1900-1950 (Cambridge, MA: Harvard, 1968)
[2] http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1952/martin-lecture.pdf

* http://pl.wikipedia.org/wiki/Chromatografia
* http://en.wikipedia.org/wiki/Chromatography
* http://en.wikipedia.org/wiki/History_of_chromatography
* http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/articles/states/richard-kuhn.html
Link