Chromatografia czarnych markerów

Czyli o tym, że czerń może się różnić od czerni.

Mając chwilkę czasu w laboratorium, zabawiłem się w rozdzielanie na składniki czarnych markerów, jakie były na stanie pracowni do szkła i plastiku:

W jaki sposób? Techniką jaka posłużyła mi do tego zadania, była chromatografia cienkowarstwowa.

O chromatografii kiedyś już pisałem (artykuł). Jest to technika rozdzielająca mieszaniny na poszczególne składniki, pozwalająca dzięki porównaniu ze wzorcami też na ich oznaczenie. Odkryta na początku XX wieku przez rosyjskiego botanika Cwieta stała się dziś jedną z podstawowych technik analitycznych.
Cały proces opiera się o zachodzenie dwóch przeciwstawnych zjawisk - adsorpcji substancji na powierzchni chłonnego materiału i jej wypieraniu przez cząsteczki rozpuszczalnika. To na ile mocno substancja zwiąże się z podłożem zależy w dużej mierze od tego co to jest za substancja i jakie jest to podłoże.
Na adsorbencie będącym materiałem polarnym, wchłaniającym wodę, łatwiej będą się osadzać substancje polarne, hydrofilowe, zaś aby je dobrze wymyć trzeba użyć także odpowiednio silnego, polarnego rozpuszczalnika. Podobne do podobnego. Siła oddziaływania substancji z podłożem zależy od budowy i wielkości cząsteczki - obecność atomów niemetali z wolnymi parami elektronowymi (tlen, siarka, azot) sprzyja tworzeniu wiązań wodorowych, które mocniej wiążą cząsteczkę. Dla układów gdy podłoże jest niepolarne, tłuste, siłę wiązania zwiększają grupy węglowodorowe. Duża cząsteczka niepolarna może się lepiej wiązać z niepolarnym podłożem niż mała.
Natomiast siła z jaką rozpuszczalnik wymywa substancję zależy od tego jak silnie z nią oddziałuje i od tego na ile silnie wiąże się z podłożem.

Wszystkie te efekty powodują, że różne substancje mają różną siłę osadzania się na materiale chłonnym, czyli różne powinowactwo. Jeśli umieścimy mieszaninę na początku masy adsorbenta i będziemy przepuszczać przez niego rozpuszczalnik, składniki najsłabiej oddziałujące z podłożem popłyną najszybciej, a te najmocniej popłyną najwolniej. Przypomina to sytuację gdy na stadionie sportowym do biegu na kilometr zgłosi się mieszanka młodzików i dobrze wytrenowanych sportowców - ci lepsi szybko oddzielą się od słabszych, tworząc osobną grupkę.
Spróbujmy zrozumieć na czym polega to zróżnicowanie prędkości. Powierzchnia ziaren podłoża jest na tyle duża, że rozpuszczona porcja substancji nie przepływa po prostu kanalikami, tylko zostaje cała skutecznie wyłapana i osadzona. Ale zarazem z tyłu czysty rozpuszczalnik wymywa substancję i przeprowadza przez nasycone ziarna do przodu, gdzie osadza się na jeszcze nie pokrytym podłożu. Bardziej więc przypomina to ruch wydmy gnanej wiatrem niż prosty przepływ. Jeśli substancja lepiej oddziałuje z podłożem, jest słabiej wymywana przez rozpuszczalnik. W efekcie więcej czasu pozostaje związana i zostaje w tyle za lepiej wymywanymi.
W ten sposób skomplikowane mieszaniny kilkunastu czy kilkudziesięciu składników mogą zostać rozdzielone.

Barwne składniki wyciągu z zielonych liści

W moim przypadku podłożem, adsorbentem, była cienka warstwa masy krzemionkowej osadzona na aluminiowej folii. Miałem do użytku na pracowni cały arkusz, który zużywałem przy kolejnych syntezach podczas sprawdzania, czy reakcja zaszła, a gdy został mi na koniec taki nierówno wycięty kawałek, postanowiłem użyć go do opisanego tu doświadczonka.
Na starcie, nad brzegiem płytki, naniosłem kropki czterema czarnymi markerami, jakie akurat miałem dostępne. Jako naczynia użyłem najmniejszej zleweczki i przykrywki od naczynka pomiarowego. Nie pamiętam jaki dokładnie był skład rozpuszczalnika, ale generalnie był to chlorek metylenu z odrobiną octanu etylu, bo tego akurat używałem.
Aby proces chromatograficzny zachodził, należało wytworzyć ruch rozpuszczalnika w materiale płytki, użyłem tu znanego zjawiska podciągania kapilarnego - wlałem do zlewki taką ilość rozpuszczalnika, aby cały dolny brzeg był zanurzony, ale też aby zarazem same plamki mi się w nim nie moczyły, i przykryłem całość nakrywką, aby nie parowało. Zanim płytka nasiąknęła co górnego brzegu minęło kilka minut, toteż film nakręcony podczas procesu trochę przyspieszyłem:



Jak widzicie cztery z pozoru identycznie czarne plamki rozwinęły się w różnokolorowe pasma.

Generalnie rzecz biorąc nie ma czarnych barwników. Czerń powstaje wtedy, gdy substancja pochłania tak dużo światła, że oko nie rejestruje konkretnego koloru. Zwykle jednak po mocnym rozjaśnieniu czerń okazuje się być bardzo, bardzo ciemnym konkretnym kolorem. Mogą istnieć czarne pigmenty, to jest stałe substancje pochłaniające w dużym stopniu wszystkie kolory światła, tu najczęściej używany jest węgiel. Trudno jednak zastosować pigment w farbach wodnych i w flamastrach, w których tusz z wkładu przesiąka do końcówki przez porowaty materiał, działający raczej jak sito dla stałych cząstek.
Producenci używają więc mieszanek różnych barwników o dużej sile barwienia. Gdy na dany barwnik pada światło białe, pochłania on z zakresu pewne kolory a odbija inne. Jeśli dobierzemy barwniki tak, że każdy kolor będzie po trochę pochłaniany, mieszanka będzie wyglądała na czarną. A jak pokazało moje małe doświadczenie, różni producenci lubią też używać różnych, unikalnych mieszanek:

Jak widać markery Granit i BIC mają podobny składnik podstawowy - dość polarny, intensywnie fioletowy barwnik, zostający z tyłu. Zastanawiałem się czy nie jest to aby fiolet krystaliczny, ale nie miałem gencjany do porównania. Jednak dalsze składniki różnią się wyraźnie - w jednym jest to łatwo rozpuszczalny brunatny składnik, w drugim dwa składniki, jeden żółtobrązowy drugi natomiast nieco różowawy. Może być on identyczny ze składnikiem markera trzeciego "Pilot", leżącym na tej samej wysokości. Tam podstawowym barwnikiem jest leżący niżej składnik granatowy.
W przypadku czwartego markera, Pentel Pen, składniki okazały się w układzie na tyle dobrze rozpuszczalne, że bez wyraźnego oddzielenia popłynęły na sam koniec, tworząc czarną plamkę.

Ten obraz poszerzyć może badanie wyglądu płytki w ultrafiolecie, ujawniające składniki nie widoczne gołym okiem. Substancje fluoryzujące świecą własnym światłem:

Jak widzimy pojawia się nam kolejna różnica między dwoma pierwszymi markerami - BIC zawiera dodatkowy składnik świecący w ultrafiolecie na jasno niebiesko. Możliwe, że w mniejszej ilości zawierają go też dwa po bokach, słabo świecące na tej samej wysokości. Takie świecenie na brzegu kolorowej plamy oznacza, że w zastosowanym układzie rozpuszczalników nałożyły się nam na siebie dwie substancje, a więc nie udało się ich zupełnie rozdzielić.
Po co niewidoczny gołym okiem składnik w markerach? Ponieważ świeci w ultrafiolecie, to musi go też pochłaniać, jest to więc zapewne składnik chroniący pozostałe barwniki przed degradacją na świetle, powstrzymujący blaknięcie rysunków.

Różnice w składzie tuszu markerów, ale też tuszu długopisów czy atramentu piór wiecznych mają istotne znaczenie w kryminalistyce, aby wyryć czy badane dokumenty, na przykład testament, nie były później uzupełniane. Jeśli sprawca użył innego długopisu, różny skład potwierdzi dopiski. Oczywiście nie wkładamy w tym celu dokumentu do naczynia z rozpuszczalnikiem aby spojrzeć na powstające kolorowe plamki. Bądź pobiera się drobną próbkę z dokumentu i bada którąś do dokładnych technik chromatograficznych, jak wysokosprawna cieczowa, bądź wyznacza technikami nieinwazyjnymi, jak spektroskopia Ramana czy UV-Vis

A jak wykonać podobne doświadczenie u siebie w domu? Specjalistycznych płytek TLC nie trzeba kupować. Za cienki materiał chłonny wystarczy arkusz grubej bibuły, na przykład gęsty filtr do kawy, można też próbować ze sztywnym, kredowym papierem. Mi kiedyś udało się to z papierem do kserowania.
Wycinamy z papieru pasek o takiej szerokości aby zmieściły się nam kropki wszystkich flamastrów jakie chcemy zbadać, długi na kilka centymetrów. Znajdujemy wysokie naczynie o płaskim dnie, może to być słoik, szklanka, opakowanie po czymś, tak aby nasz pasek się w nim mieścił.
Teraz kwestia rozpuszczalnika - dość dobrymi, mocno wymywającymi, jest spirytus i zmywacz do lakieru do paznokci. Jeśli okażą się zbyt mocne i podczas próby wszystkie kolory od razu pójdą do góry, możemy spróbować domieszać jakiegoś słabszego składnika, może to być na przykład jakiś rozpuszczalnik do usuwania tłustych plam. Jeśli badamy markery nierozpuszczalne, pomocne może być dodanie odrobiny wody - wprawdzie jest bardzo polarna, ale gdy składniki barwne się w wodzie słabo rozpuszczają, woda może pogorszyć ich wymywanie z papieru i spowolnić. Tu już trzeba sobie poeksperymentować.

Przygotowaną mieszankę wlewamy na dno naszego naczynia, wkładamy pasek papieru z naniesionymi u dołu kropkami markerów tak aby opierał się o ściankę. Ponieważ nasiąkający papier traci sztywność, aby się nam nie przewrócił i nie wpadł możemy bądź zawinąć górny brzeg na brzegu naczynia, lub użyć spinacza do papieru, ewentualnie przewlec nitkę przez otwór w papierze i podwiązać. Pasek nie powinien przylegać do ścianki naczynia, rozpuszczalnik będzie wówczas podsiąkał w szczelinie między nimi i całość się rozmyje. Naczynie czymś przykrywamy aby rozpuszczalnik nie parował i czekamy aż cały pasek nasiąknie.

Ostatnio w laboratorium (53.)

Z zajęć na temat krystalochemii - kryształy paracetamolu pod mikroskopem:

Nie zupełnie foremne i z inkluzjami. Miały długość około 1 mm.

Wczoraj w laboratorium (52.)

Wczoraj w laboratorium zająłem się destylacją tiofosgenu - strasznie śmierdzącego i trującego odczynnika.

Tiofosgen to formalnie rzecz biorąc podwójnie zchlorowana grupa tiokarbonylowa. Jego tlenowy analog fosgen był kiedyś używany jako bojowy gaz duszący, co daje już jakieś pojęcie o własnościach.

Zapach nie jest taki zły, jak oczekiwałem sądząc po obecności siarki. Jest ostry, drażniący a przede wszystkim duszący, podobny do innych prostych chlorków kwasowych.

Po co mi on? Do syntezy tiokarbonylodiimidazolu, a ten z kolei jest mi potrzebny do dalszych syntez. Po przeliczeniu wyszło mi, że taniej będzie otrzymać TCDI z tiofosgenu niż zamawiać gotowy. O ile uda się go w końcu zrobić bo już trzy razy próbowałem i powstawały różne dziwne produkty.

Ostatnio w laboratorium (51.)

Ostatnio w laboratorium rozdzielałem ciemną, zesmołowaną mieszaninę poreakcyjną na kolumnie z wypełnieniem krzemionkowym. Eluent (chloroform/metanol) miał współczynnik załamania na tyle zbliżony do ziaren krzemionki, że całość wydawała się przezroczysta. Dzięki czemu bardzo ładnie było widać, jak mieszanina rozdziela się na poszczególne składniki, tworzące osobne prążki:

Nałożyłem trochę za dużo i kolumna się przeładowała, ale to o co mi chodziło udało się oddzielić.

Ostatnio w laboratorium (50.)

Gdy wykonuje się małą chromatografię na płytce wycinanej z arkusza, należy pilnować aby brzeg był równy. Jeśli bowiem żel odpryśnie się nierówno na brzegach, eluent będzie szybciej wsiąkał od tej strony, zaś plamki substancji zostaną przesunięte w przeciwną.

W poniższym przypadku nierówny brzeg z obu stron zaowocował dość walentynkowym efektem wizualnym:

Ostatnio w laboratorium (49.)

Ostatnio w laboratorium wykonywałem reakcję redukcji grupy nitrowej pyłem żelaznym, i po jej zakończeniu postanowiłem przeprowadzić jeszcze jeden prosty, acz zaskakujący eksperyment.

Standardowym sprzętem laboratoryjnym jest mieszadło magnetyczne. Wewnątrz podstawki, często z możliwością podgrzewania, działa magnes który oddziałuje na mieszadło mające postać podłużnej kapsułki. Wirujący magnes w podstawce wymusza wirowanie mieszadełka a zawartość naczynia z takim mieszadełkiem jest intensywnie mieszana.
I otóż widząc jak pył użyty w reakcji czepia się mieszadełka, zastanowiłem się jak wyglądają linie pola magnetycznego podstawki. Położyłem więc na mieszadło kartkę i szalkę Petriego, po czym sypnąłem odrobinę pyłu, który ułożył się w polu w formie podłużnych pasm i prętów:

Pod wpływem pola magnetycznego opiłki sama nabierają magnetyczności. Każdy staje się małym magnesem i ma skłonność przyciągać przeciwny biegun innego, przez co drobne cząstki sklepiają się w sznury. Wskutek samoorganizacji pył żelazny formuje cienkie igły ustawione równolegle do pola i oddzielone pustymi przestrzeniami. Nad biegunami, gdzie linie pola przecinają płaszczyznę pod kątem prostym, tworzy się struktura najeżonych kolców:

Samo uwidocznienie statycznej struktury nie było jednak tak ciekawe, jak zachowanie się pyłu po włączeniu mieszadła:

Igiełki namagnesowanych cząstek zlepiły się w płaski, harmonijkowaty kształt, który nawet przy wysokiej prędkości wirowania zachowywał integralność.

Ostatnio w laboratorium (48.)

Ostatnio w laboratorium po skończeniu wydawałoby się prostego przekształcenia musiałem rozdzielić mieszaninę poreakcyjną, która wbrew przepisowi przybrała kolor brunatno-zielony. Gdy już z kolumny chromatograficznej zeszła większość frakcji, końcowe zanieczyszczenia rozwinęły się, ukazując swe dość intensywne, jak na to rozcieńczenie, i różnorodne kolory:

Cóż, gdyby nie to, że spieszę się aby do końca miesiąca przebrnąć przez najważniejszy etap syntezy katalizatora, wolałbym sprawdzić co też takiego dziwnego mi tu powstało. Na razie jedynie kolory te oznaczają, że powstała mi znaczna ilość produktów ubocznych, jakich tu być nie powinno, toteż chyba będę musiał użyć nieco mniej agresywnych reagentów...

Dziś w laboratorium (47.)

Dziś w laboratorium po wyłączeniu dość prostej reakcji redukcji i rozwinięciu kropli, otrzymałem na płytce TLC oświetlonej ultrafioletem zjawiskowy wzór składników mieszaniny poreakcyjnej:

Wzór efektowny ale też nieco niepokojący bo oznacza, że reakcja która powinna zajść czysto i niemal ilościowo wytworzyła dużo więcej produktów o różnorodnych właściwościach niż to zakładałem.

Kiedyś w laboratorium (47.)

Kiedyś na zajęciach z analityki robiliśmy doświadczenie z elektroforezą aminokwasów.

Aminokwasy zgodnie z nazwą są związkami, które zależnie od warunków mogą być kwasami lub zasadami - posiadają grupę karboksylową mogącą odszczepiać proton, która zwykle decyduje o właściwościach kwaśnych, oraz grupę aminową która mogłaby przyjąć proton w odpowiednio zakwaszonym środowisku. W szczególnych warunkach zjonizowane są obie grupy i punkt ten nazywany izoelektrycznym.
 Ponieważ w aminokwasach o różnej budowie stała protonowania grupy aminowej i stała deprotonacji grupy karboksylowej przybierają różne wartości, toteż w roztworach o tym samym odczynie różne aminokwasy będą przyjmowały bądź formę anionu bądź kationu. A gdy do roztworu przyłożymy napięcie elektryczne, każdy pomknie w inną stronę.

Przyciąganie jonów do elektrody o przeciwnym znaku powoduje ich migrację, której prędkość zależy od wielkości i stopnia naładowania cząsteczki. Wskutek tego możliwy staje się rozdział naładowanych cząstek w polu elektrycznym na podobnej zasadzie jak to się ma przy chromatografii. Techniki tej używa się do rozdziału białek, peptydów i fragmentów DNA na przykład podczas badań genetycznych, co kiedyś już opisywałem.

W tym przypadku jednak poprzestaliśmy na sytuacji dużo prostszej - na kilka pasków bibuły nasączonej przewodzącym buforem nałożyliśmy próbki kilku aminokwasów i przez pewien czas podłączyliśmy paski do elektrod. Te aminokwasy które w odczynie buforu były anionami pomknęły w stronę elektrody dodatniej zaś te będące kationami w stronę elektrody ujemnej. Plamy aminokwasów ujawnialiśmy ninhydryną:

Jak dogrzebię się do starego zeszytu to dopiszę jeszcze który pasek odpowiadał któremu z aminokwasów.

Kiedyś w laboratorium (46.)

Kiedyś na zajęciach z chemii nieorganicznej robiliśmy doświadczenie z barwieniem skrobi jodem. Zawiesinę zabarwionej skrobi obserwowaliśmy potem przez mikroskop. Niestety użyliśmy za dużo jodu i zamiast struktury ziarna, obserwowaliśmy tylko czarne grudki:

Skrobia zabarwiona jodem, pow. około 400 razy

Jednak gdy przeglądałem preparat, szukając jakiegoś ładnego kadru, natrafiłem na nieoczekiwany bonus - fragment tkanki roślinnej, który bardzo ładnie zabarwił się na niebieskawo:

Widać dobrze jądro jednej z komórek i chyba jakieś zawieruszone organelle.

Kiedyś w laboratorium (45.)

Zdjęcia z archiwum - po zakończeniu ćwiczenia na preparatyce, podczas którego używaliśmy stopionego fenolu, zwróciłem uwagę na piękny pęk włóknistych kryształów powstały na dnie zlewki:

Wyglądały trochę jak lód. Sam fenol w formie proszku był nieco różowawy.


ps. Dopiero teraz zauważyłem, że to mój 200 wpis.

Kiedyś w laboratorium (44.)

Gdy jeszcze zajmowałem się syntezami na potrzeby pracy magisterskiej, zaintrygował mnie sposób w jaki wykrystalizowała jedna z otrzymanych oksazolin:

W miarę odparowywana na wyparce, stężenie związku z cienkiej warstwie roztworu rosło, aż od pewnego punktu rozpoczęła się szybka krystalizacja. Jednak zamiast promienistych igieł, kryształy uformowały wyraźne prążki. Musiała nastąpić jakaś specyficzna organizacja, tworząca regularny kształt:

Z innymi oksazolinami czegoś takiego nie obserwowałem. Później zagęszczałem jeszcze jedną frakcję z tym związkiem i w innym naczyniu zachował się identycznie, widocznie to jego właściwość.

ps. znalazłem pracę w IChO PAN w Warszawie, za parę dni opiszę szerzej.

Kiedyś w laboratorium (43.)

We wpisie na temat metod ujawniania odcisków palców wspominałem o traktowaniu badanych powierzchni jodem, który wchłaniając się w tłuszczowy ślad odbitki linii papilarnych, zabarwia je na żółto.

Jeszcze zanim skończyłem pracownię magisterską miałem okazję to przetestować, przy okazji wywoływaniu chromatogramu w jodzie. Kawałek papieru do ksero przyciśnięty mocno palcami, włożyłem do słoiczka ze stałym jodem, po kilku chwilach odciski ujawniły się dość dobrze, ten który znalazł się bliżej dna, zabarwił się aż nadto:

mimo wszystko kontrast był słaby. Być może jednak przypominacie sobie, iż ślady ujawniane jodem można było wzmocnić opryskując je roztworem skrobi. Akurat takiej zawiesiny na podorędziu nie miałem, ponieważ jednak papier często jest wygładzany przez powleczenie masą zawierającą skrobię, postanowiłem delikatnie zwilżyć papier - przyłożyłem go do ust i nachuchałem aż zwilgotniał.
Rzeczywiście ślady pociemniały a nawet sfioletowiały:

Metoda działa.

Kiedyś w laboratorium (42.)

Dawno, dawno temu za wieloma latami, uczyłem się bioanalizy i jednym z ćwiczeń było identyfikowanie szczepów bakterii przy pomocy szeregu podłóż różnicujących. Szereg w całości omówię kiedy indziej, natomiast teraz na szybko opowiem o jednym podłożu - agarze TSI czyli trójcukrowy żelazowy.

Jest to podłoże produkowane w formie słupkoskosu - próbówka w części napełniona w całym przekroju, jest to tzw. "słupek", a w części napełniona ukośnie:

Podłoże zawiera barwnik czerwień fenolową, siarczan żelaza, tiosiarczan sodu oraz cukry: laktozę, glukozę i sacharozę. Rozróżnianie bakterii opiera się na strasznie prostej zasadzie - czy bakteria metabolizuje cukry i które i czy przerabia tiosiarczany na siarczki.
Metabolizowanie cukrów powoduje powstanie kwaśnych metabolitów, pod wpływem których czerwień fenolowa robi się żółta. jeśli bakteria fermentuje glukozę, podłoże początkowo będzie żółte, lecz ulatnianie kwaśnych produktów ze skosu spowoduje, że będzie on czerwony a słupek zółty. Metabolizowanie laktozy daje żółte zabarwienie obu części
Jeśli bakteria metabolizuje tiosiarczan do siarkowodoru, zareaguje on z żelazem, dając czarny osad siarczku żelaza. W przypadku badanego szczepu wynik był następujący:

Zmieniona barwa słupka - zatem bakteria metabolizująca glukozę, zapewne enterobakteria. Czarny pierścień - zatem metabolizuje tiosiarczany. W tym przypadku była to salmonella, być może serotypu Typhi, już nie pamiętam.

A teraz na parę dni wyjeżdżam na zlot astronomiczny. Życzcie mi dobrej pogody.

Barwienie bakterii metodą Grama

Dawno, dawno temu, kiedy jeszcze uczyłem się w technikum chemicznym, jednym z przedmiotów była bioanaliza, gdzie uczyliśmy się jak badać mocz, rozpoznawać pod mikroskopem różne limfocyty, albo badać zawartość cholesterolu w osoczu.
Jednym z ciekawszych ćwiczeń była hodowla bakterii z powietrza - sterylną płytkę z podłożem odkrywało się na określony czas w nieruchowym powietrzu pomieszczenia, zakrywało i wstawiało do inkubatora. Bakterie które znajdowały się w powietrzu osiadały na płytce i tworzyły kolonie - jedna bakteria tworzyła jedną kolonię. Zliczając ilość kolonii na powierzchni płytki i znając czas wystawienia płytki, można było policzyć stężenie bakterii w powietrzu - całkiem proste.

Jednak otrzymane bakterie dobrze jest też jakoś zidentyfikować. Oprócz opisanych już kiedyś metod hodowli na podłożu różnicującym, inną techniką jest barwienie metodą Grama. Badanie obejmuje kilka etapów, a wszystkie je sfotografowałem.

Zasadnicza różnica między typami bakterii jaką wykrywa się w tym badaniu, to grubość i przenikliwość ściany komórkowej - w jednym bakteriach jest cienka, w innych stosunkowo gruba. Ma to wpływ na ogólną fizjologię bakterii, zaś dla medycyny znaczenie ma różna wrażliwość na leki - zasadniczo bakterie o grubszej ścianie komórkowej są bardziej odporne, z powodu słabszego wchłaniania antybiotyku do wnętrza. Różna grubość ścian komórkowych wykrywana jest przez selektywne wybarwianie fioletem krystalicznym. W jaki sposób?

Na początek należy sobie wybrać jakąś kolonię z której będziemy robić rozmaz:

Ja akurat wybrałem sobie taką w której na kolonię żółtą naciekała biała, mając nadzieję że uda mi się złapać dwa różne typy. Masę kolonii pobierałem ezą, to jest pętelką z drutu z rączką. Tę jednak należało przedtem wyżarzyć, aby usunąć wszystkie inne bakterie:

Ponieważ kolonia miała postać stałej masy, najpierw nabrałem nieco soli fizjologicznej:

potem nieco kolonii:

i rozmazałem na płytce:

Rozmaz należało teraz wysuszyć i utrwalić, aby bakterie dobrze przylegały do podłoża. Dlatego po podsuszeniu w suszarce przeciągnęliśmy płytki nad płomykiem lampki spirytusowej, tak aby masa bakteryjna "przyschła" do płytki.

Wszystkie płytki należało teraz umieścić nad tacką, założyć rękawiczki i uważać na ubranie, bo można się było nieźle pobrudzić. Najpierw każda płytka została zalana roztworem fioletu krystalicznego:

Następnie czekaliśmy dwie minuty, po czym zlaliśmy barwnik do tacki:

Nie usuwając całej cieczy, zalewaliśmy płytki płynem Lugola - na powierzchni płynu powstawała błyszcząca warstewka, jak podejrzewam był to wydzielający się jod. Płyn dzięki temu błyszczał i opalizował, wyglądając jak odwłok złotego żuka:

Po około trzydziestu sekundach zlaliśmy ciecz i dokładnie przemyliśmy alkoholem:

A następnie wodą:

Na sam koniec zalaliśmy płytki roztworem fuksyny:

Pół minuty potem zlaliśmy ją do tacki, płytki przemyliśmy wodą i osuszyliśmy w suszarce. Tak zabarwione płytki nadawały się do badania mikroskopowego:

Co takiego następowało podczas wybarwiania? Gdy zalewaliśmy płytki roztworem fioletu krystalicznego, wnikał on do bakterii zabarwiając je wszystkie. Dodany potem roztwór jodu dodatkowo przyciemniał zabarwienie poprzez tworzenie kompleksów jodu z barwnikiem. Na tym etapie zabarwione były wszystkie.
Jednak gdy przemywaliśmy płytki alkoholem, zaznaczyła się różnica - łatwo wypłukiwał on barwnik z bakterii o cienkiej ściance, natomiast nie był w stanie odbarwić bakterii o ścianie grubej. W efekcie te pierwsze stawały się bezbarwne, zaś te drugie ciemnofioletowe. Gdy zalaliśmy płytki fuksyną, odbarwione bakterie o cienkiej ścianie zabarwiły się na różowo. Te o grubej także, ale mocniejszy kolor fioletu zagłuszał róż.
W efekcie bakterie o ściance cienkiej zabarwiły się na różowo a te o grubej na ciemno fioletowo. Rożróżnianie bakterii pod mikroskopem jest zatem bardzo łatwe - bakterie Gram+ są fioletowe a Gram- różowe.

Akurat mnie, jako chemika-estetę bardziej zainteresowały kryształy fuksyny, które wykrystalizowały na płytce. Tutaj pęk kryształów w otoczeniu bakterii gram-ujemnych (powiększenie ok. 400X):

A tutaj w otoczeniu gram-dodatnich (pow. ok. 600X):

I na koniec mieszanka dwóch różnych typów bakterii:

Kiedyś w laboratorium (41.)

Kiedyś zauważyłem na pracowni interesujący efekt - po suszeniu THF metalicznym sodem, gdy zestaw już ostygł, cały użyty sód wypłynął w formie równej kuli, mniej więcej wielkości orzecha laskowego:

Uznałem że to ciekawe nie tylko z przyczyn wizualnych - sód jest wprawdzie lekki, ale ma gęstość nieco większą od THF. Najwyraźniej rozpuszczony benzofenon i produkty jego reakcji z wodą na tyle zagęściły rozpuszczalnik, że stał się minimalnie gęstszy od metalu. Skoro jednak metal przyjął kształt kuli, najwidoczniej dla ciekłego sodu gęstości stają się zbliżone.

Czasem w laboratorium (40.)

Często w laboratoriach przez dłuższy czas używa się tych samych, przymocowanych na stałe, chłodnic szklanych, na przykład w zestawach do suszenia rozpuszczalników lub w wyparkach. Woda w nich nie zawsze jest spuszczana po użyciu, toteż wewnątrz, w wilgotnych i dobrze doświetlonych warunkach, chętnie rosną zielonkawe glony:

Wedle zasłyszanej opinii chemicy dzielą się na tych, który co jakiś czas rozbierają chłodnicę i czyszczą glony, i tych którym to nie przeszkadza, na zasadzie "jak będzie za duże to się spłucze".

Zawsze to jakaś roślinka...

Kiedyś w laboratorium (39.)

W trakcie sprawdzania reaktywności jednego z ligandów, okazało się że daje on z miedzią dosyć trwałe połączenie - na tyle, że wytrącało się z izopropanolu w postaci ciemnobrązowego proszku, możliwego do oddzielenia. Podjąłem się próby wyizolowania kompleksu, i udało mi się odsączyć małą porcję, wyglądem przypominającą kawę rozpuszczalną:

Proszek był bezpostaciowy. Ponieważ połączenie wydawało się dosyć trwałe, postanowiłem je przekrystalizować - otrzymanie kryształów i zbadanie ich rentgenowsko mogłoby potwierdzać teorie na temat struktury kompleksu powstającego podczas reakcji, co było tym bardziej ciekawe, że dla tego typu ligandów jeszcze się to nie udało.
Rozpuściłem więc kompleks w chlorku metylenu, otrzymując żółtobrązowy roztwór:

Po czym wstawiłem całą fiolkę do naczynia z oktanolem. Ten mało lotny alkohol alifatyczny nasycał sobą powietrze w naczyniu, po wstawieniu fiolki część oktanolu z par rozpuszczała się w fiolce, zmniejszając rozpuszczalność związku. Równocześnie część chlorku odparowywała i rozpuszczała się w oktanolu.
Ta wyrafinowana technika miała powoli zatężać roztwór i sprzyjać powstaniu kryształów.

Niestety nie udało się - chlorek po kilku dniach odparował do końca a kompleks zbił się w bezpostaciowe kuleczki. Bywa.

Natomiast pisanie pracy idzie mi jak przez bagna.

Chemiczne ogrody

Każdy pewnie kiedyś słyszał o tym doświadczeniu - do odpowiedniego roztworu wrzuca się małe kryształki, i po chwili zaczynają z nich wyrastać łodyżki i gałązki, podobne do fantastycznych wodorostów albo kwiatów. Mieliśmy coś takiego w małej skali na drugim roku:

Pytanie zatem - jak to powstaje i jak można coś takiego samemu zrobić?

Sama procedura sporządzania jest bardzo prosta - naczynie napełnia się roztworem krzemianu sodu, po czym wrzuca do niego kryształki soli metali przejściowych. Wokół kryształka powstaje mała banieczka, która uwypukla się aż z jej szczytu wysnuwać się zaczyna cienka wić, czasem rozgałęziająca się. Stopniowo wzrasta aż dotrze do powierzchni gdzie czasem jeszcze jest zdolna wyprodukować pływające zgrubienie. Gdy "roślinki" przestają rosnąć, naczynie można zamknąć i postawić w widocznym miejscu.

Krzemian sodu to inaczej szkło wodne, możliwe do dostania jako środek konserwujący do kamienia i betonu, natomiast sole metali przejściowych powinny być możliwe do kupienia w sklepach z odczynnikami. Samo wykonanie we własnym zakresie nie jest więc tak skomplikowane.

Mechanizm powstawania takich tworów także.

Szkło wodne, to roztwór krzemianów sodu i potasu, które można otrzymać stapiając krzemionkę z wodorotlenkami tych pierwiastków. Powstałe krzemiany tworzą gęsty, dosyć lepki roztwór o lekko opalizującym wyglądzie. Prawdopodobnie roztwór nie zawiera swobodnych anionów krzemianowych, lecz różnej wielkości połączenia liniowe i rozgałęzione aż do rozmiaru cząstek koloidalnych. Jest to  i tak dobrze, bo z większością metali kwas krzemowy daje sole nierozpuszczalne.

Dodawane przez nas sole zwierają właśnie te metale, dające nierozpuszczalne krzemiany, dlatego gdy wrzucimy do roztworu kryształek, powstanie na nim natychmiast nierozpuszczalna warstewka krzemianu i reakcja ustanie. Warstewka ta nie przepuszcza krzemianów, więc reakcja nie może postępować dalej.

Zarazem jednak jest to warstewka na tyle cienka, iż przepuszcza wodę, stanowi więc błonę półprzepuszczalną. Gdy woda zacznie przenikać pod błonkę, rozpuści kryształek soli wewnątrz, tworząc bardzo stężony roztwór.

Prawa osmotyki mówią, że jeśli dwa roztwory o tym samym rozpuszczalniku ale różnych stężeniach przedzielimy membraną, przepuszczającą rozpuszczalnik, to zacznie on przenikać z roztworu mniej stężonego do bardziej. Ma to źródło w prostych prawach - od strony roztworu bardziej rozcieńczonego w membranę uderza w tym samym czasie więcej cząsteczek wody niż od strony bardziej zatężonego, można więc mówić o wyższym ciśnieniu cząstkowym; jeśli zaś część uderzających w błonkę cząsteczek może przez nią przeniknąć, to będzie następował przepływ rozpuszczalnika. W momencie gdy ciśnienia cząstkowe po obu stronach się wyrównają, bo roztwór bardziej rozcieńczony się zatężył a bardziej stężony rozcieńczył, przepływ ustaje.

Przepływ ten może, w sytuacji gdy błonka otacza pewną zamkniętą przestrzeń, doprowadzać do znacznego wzrostu ciśnienia, lub zmienić poziom roztworu, co też następuje w naszym przypadku - błonka wokół kryształu napina się, rozpierana rosnącą objętością roztworu, aż pęka. Gdy tylko błonka pęknie w jakimś punkcie, wokół wylewającej się porcji roztworu soli powstaje na nowo cienka błonka krzemianów. Przez błonkę do środka wnika woda, rozpuszcza się nowa porcja soli a ciśnienie rośnie do kolejnego pęknięcia.

Wzrost roślinek jest więc wynikiem ciągłego rozrywania wciąż powstającej błonki, i trwa do momentu aż rozpuści się cała sól z wrzuconego kryształka, a stężenia między środkiem a zewnętrzem się wyrównają.

Jeśli chodzi o kształt, to jest determinowany przez dwie siły - ciśnienie hydrostatyczne i siłę wyporu. Wielkość ciśnienia hydrostatycznego zależy od wielkości słupa roztworu nad danym punktem. O góry rosnącej błonki słup ten, a więc i ciśnienie, są nieco niższe niż przy dnie, dlatego tam najłatwiej jest ciśnieniu wewnątrz rozerwać błonkę i gałązka rośnie do góry. Dodatkowo roztwory soli w pęcherzyku są zwykle nieco lżejsze niż szkło wodne i dlatego powstająca gałązka zachowuje pion. Jakieś znaczenie mają też pęcherzyki powietrza przyczepiające się do błonki.

Kolor powstającej roślinki zależy od dodanej soli. Chlorek wapnia i siarczan glinu dadzą pędy białe, siarczan miedzi niebieskie, chlorki chromu III, niklu II i żelaza II dadzą rośliny zielone o różnych odcieniach, chlorek kobaltu da roślinę fioletowo-różową. Kształt pędu bardziej zależy od wielkości i kształtu pierwotnej grudni niż od rodzaju soli. Swój wpływ ma też stężenie szkła wodnego, od którego zależy grubość pędów.
Zastanawia mnie czy efekt taki dałyby kryształy kwasu cytrynowego, który powinien pokrywać się błonką uwodnionej krzemionki.

Doświadczenie to znane jest od dawna, i znane są liczne jego warianty. do najciekawszych należy chyba eksperyment na międzynarodowej stacji kosmicznej, gdzie chciano sprawdzić, czy w stanie nieważkości roślinki przybiorą jakieś ciekawe kształty - okazało się że brak kierowania przez ciśnienie hydrostatyczne, powoduje powstawanie nieregularnych odgałęzień skierowanych w różne strony.

Plując do próbówki - test na enzymy śliny

Badanie enzymów śliny stanowiło jedno z ciekawszych ćwiczeń na bioanalizie, przynajmniej pod względem procedury przeprowadzenia.

Ślina stanowi wydzielinę gruczołów zlokalizowanych w jamie ustnej, głównie ślinianek dużych, zlokalizowanych przy uszach, pod językiem i w szczęce, oraz drobniejszych ślinianek rozsianych na powierzchni języka i policzków.
Stanowi skomplikowany roztwór zawierający sole mineralne, głównie wapń, magnez, sód i potas, aniony kwasów organicznych, głównie cytrynowego, fosforowego i węglowego, anion tiocyjanianowy i wiele innych. Czynnikiem zagęszczającym i zwiększającym lepkość są białka mucyny tworzące żele. Oprócz nich ślina zawiera też wiele enzymów i czynników odpornościowych, pełniących funkcję obronną. Lizozym, obecny też w łzach, niszczy błony komórek bakterii Gramm dodatnich. Laktoferyna wiąże ślady żelaza, potrzebnego do rozwoju wielu bakterii. Immunoglobuliny atakują bakterie i pierwotniaki. Laktoperoksydaza utlenia patogeny, pełniąc też rolę odkażającą w mleku.
Inne składniki ochraniają tkanki jamy ustnej i gardła - lekko zasadowy odczyn i obecność soli mineralnych hamuje wypłukiwanie wapnia ze szkliwa, czynniki wzrostu, białka przeciwzapalne i stymulujące przyspieszają gojenie się ran wewnątrz jamy ustnej - zwierzęta wiedzą co robią gdy wylizują sobie rany. Z drugiej strony są bakterie które jakoś sobie w tych warunkach radzą, o czym świadczą choćby problemy dentystyczne, wywoływane przez szczepy zakwaszające ślinę.

Co jednak równie ważne, ślina zawiera też enzymy trawienne, toteż żucie i mieszanie z nią pokarmu przed przełknięciem, jest pierwszym etapem trawienia. Ślinowa lipaza uaktywniana po przełknięciu w żołądku rozpoczyna trawienie tłuszczów, u noworodków które jeszcze nie zaczęły wytwarzać lipaz w trzustce, ta ze śliny jest jedyną dostępną. Rybonukleaza zaczyna trawić kwasy nukleinowe. Białko haptokoryna chroni witaminę B 12 przed rozkładem w żołądku. Tak więc jak widzicie, dobre przeżucie jedzenia to podstawa.
Dla mojego doświadczenia najistotniejsze były jednak enzymy trawiące wielocukry - ślinowa amylaza rozbija długie łańcuchy skrobi, dzieląc wiązania glikozydowe, i odczepiając cząsteczki maltozy, złożonej z dwóch cząsteczek glukozy. Drugi enzym maltaza rozbija go na glukozę, ale ma to już mniejsze znaczenie. Ogółem skrobia zostaje rozbita na dekstryny i maltozę, będąc trawioną w ok. 30%, reszta zostanie przerobiona przez amylazę trzustkową w jelitach

O aktywności amylazy możemy się niekiedy przekonać podczas długiego żucia chleba - zwykły, pozbawiony słodyczy chleb, po dłuższym przeżuciu staje się słodkawy, co czuć zwłaszcza przy przełykaniu - powstająca maltoza jest lekko słodka. Właściwości śliny są też używane do produkcji napojów alkoholowych - południowoamerykańska Chicha jest produkowana z przeżutej kukurydzy. Wypluwki mieszane są w cieple w dużym naczyniu, gdzie następuje rozkład skrobi. Dopiero do tego dodaje się zakwas z bakteriami, które wywołują fermentację proadząc to powstania niskoprocentowego napoju alkoholowego. Z kolei z przeżutego manioku Indianie wytwarzali masato, którego przygotowanie i spożywanie było obrządkiem plemiennym.

W jaki sposób można zbadać enzymy śliny? W naszym przypadku oparliśmy się na właściwościach amylazy do rozkładania skrobi. Skrobia jak wiadomo tworzy z jodem intensywnie granatowy kompleks, pozwalający wykryć skrobię lub jod. Jeśli enzym rozłoży skrobię na maltozę bądź krótkołańcuchowe dekstryny to zabarwienie pod wpływem jodu nie będzie się pojawiać. I tak oto przedstawia się cała idea badania. Ale najpierw trzeba zdobyć próbkę śliny.

W tym celu z grupy mającej zajęcia wybrano dwie osoby i tak się złożyło że byłem jedną z nich. Każdy dostał po próbówce i połówkę cytryny, aby jej zapach pobudzał wydzielanie śliny. Akurat w moim przypadku najzupełniej wystarczało samo wyobrażanie sobie zjadania cytryny. Należało zgromadzić kilka centymetrów śliny, tak aby starczyło na całą grupę.
Gdy już zebraliśmy wystarczającą objętość, ślina została rozcieńczona i przesączona.
Wcześniej przygotowaliśmy ok. 1% zawiesinę skrobi w wodzie. Rozdzieliliśmy ją na cztery próbówki, które zanurzyliśmy w łaźni wodnej nastawionej na 40 stopni, bo w tej temperaturze amylaza działa najszybciej i gdy już się ogrzały, do połowy dodaliśmy roztworu śliny a do drugiej połowy równą ilość czystej wody, otrzymując próbę kontrolną. Następnie próbówki ogrzewały się w łaźni przez pół godziny.
Gdy już minął przepisowy czas, do wszystkich czterech próbówek dodaliśmy kilka kropli płynu Lugola, zawierającego jod. Otrzymaliśmy następujący widok:

Zdjęcie trochę drgnięte, ale widać co trzeba - w połowie próbówek, w tych kontrolnych, zawartość zabarwiła się na granatowo. W tym z dodaną śliną stała się brązowa. Oznacza to że w próbie kontrolnej nie uległa zmianie skrobia, natomiast w tej ze śliną została rozłożona na nie dające reakcji barwnej fragmenty.
Zatem nasza ślina zawierała ten enzym.

Podobny enzym zawiera też ślina pszczół, a co za tym idzie również miód. Dzięki temu można zbadać, czy miód nie był klarowany przez podgrzewanie, bowiem amylaza ogrzana powyżej 45 stopni trwale traci swoje właściwości. Przebieg takiego badania jest bardzo podobny do badania śliny - próbkę miodu rozcieńcza się i miesza z zawiesiną skrobi. Całość utrzymuje się w cieple w około 35-40 stopni przez jedną lub kilka godzin, po czym sprawdza zabarwienia roztworem jodu. Brak zabarwienia świadczy o tym że miód zawiera aktywny enzym.
Szczegółowy przepis podawał Stobiński w książce "Chemia i Życie", którą zresztą polecam, dobry opis możecie znaleźć tutaj.
W przemyśle aktywność amylaz miodu określa się przy pomocy liczby diastazowej - jest to ilość mililitrów 1% zawiesiny skrobi, które jest w stanie w ciągu godziny zhydrolizować 1 gram miodu. Niska wartość świadczy o podgrzewaniu lub chrzczeniu syropem cukrowym.