Chemiczne wieści (12.)

Zjonizowane białko najsilniejszym kwasem
Kwasami w ujęciu Brønsteda są substancje, które w reakcji z zasadą odszczepiają proton tworząc anion. Najbardziej znaną skalą określającą ich moc jest skala pH opierająca się o stężenie jonów hydroniowych, które powstają w wyniku reakcji kwasu z wodą. Im większe jest stężenie tych jonów, tym niższa jest cyfra określająca kwaśność roztworu (ujemna skala logarytmiczna). W szczególnych przypadkach dla bardzo silnych kwasów przyjmuje wartości ujemne.
Jak łatwo zauważyć po przeanalizowaniu definicji, skala ta w pewnych przypadkach staje się niewygodna czy wręcz niefizyczna. Trudno zastosować ją na przykład do ciekłych substancji pozbawionych wody jak na przykład 100% kwas siarkowy, bo brak w nich jonów hydroniowych. Jest też problematyczna w roztworach tak bardzo stężonych, że molowo jest w nich więcej kwasu niż wody. Dlatego do tych innych substancji stosuje się inne skale, oparte najczęściej o wartość pKa zależną od stężeń jonów, bądź o energię reakcji oderwania protonu. W ten sposób możemy porównywać kwasowość na przykład stałych, ciekłych i gazowych węglowodorów, stwierdzając, że acetylen jest kwaśniejszy od metanu i łatwiej będzie tworzył sole.

No i niedawno wykryto specyficzną substancję, dla której entalpia deprotonacji jest tak wysoka, że musi to być najsilniejszy kwas organiczny.

Cytochrom c to enzym stanowiący ważny element oddychania komórkowego, ma też udział w procesie apaptozy, dlatego jest intensywnie badany. Składa się on z białka złożonego ze 104 aminokwasów połączonych z cząsteczką hemu. Ostatnie odkrycie dotyczy jednak nie samego cytochromu lecz jego wersji silnie sprotonowanej. W odpowiednich warunkach można dodać cząsteczce dodatkowych atomów wodoru. Na przykład grupy aminowe białka mogą przyjąć wodór, zamieniając się w dodatnio naładowane grupy amoniowe. Tak nawodorowane cząsteczki będą też oczywiście chętnie oddawać nadmiarowe protony, aby przejść do stanu pierwotnego. Im mocniej uwodorniona jest cząsteczka, tym chętniej oddaje proton, to jest staje się coraz mocniejszym kwasem.

Zespół naukowców z Australii badał powstawanie jonów białkowych w spektrometrze mas. Roztwór białka został rozpylony w silnym polu elektrycznym wewnątrz komory. Ponieważ takie same ładunki odpychają się, małe kropelki rozdzielały się na jeszcze mniejsze, ż na koniec powstała chmura kropelek z pojedynczymi cząsteczkami białka. Ta technika nazywana elektrosprejem pozwala na otrzymanie widma mas całych cząsteczek.
Do roztworu dodano jednak pewien prekursor chętnie w takich warunkach oddający protony. W efekcie powstały cząsteczki uwodornione w ekstremalnym stopniu, zawierające nawet 30 dodatkowych wodorów i ładunek elektryczny 30+. Gdy otrzymamy już chmurę jonów, możemy próbować poddawać je reakcjom z różnymi związkami o znanej energii uwodornienia. Wykrycie kationów pochodnych od tych dodatkowych substancji, cięższych o jeden wodór, umożliwia wyznaczenie energii reakcji. W tym przypadku cząsteczka naładowana do 30+ oddawała proton z energią 130 kJ/mol. Jest to tak duża wartość, że zjonizowany cytochrom protonował azot, czy gazy szlachetne[1]

Najdłuższy acen
Aceny to węglowodory aromatyczne złożone z liniowo ułożonych sześciokątnych pierścieni, połączonych jednym bokiem. Najprostszy acen to naftalem złożony z dwóch pierścieni. Trzy zawiera antracen, cztery tetracen, pięć pentacen. Tych pierwszych kilka związków występuje naturalnie, i izolowano je głównie ze smoły pogazowej, niektóre znalazły zastosowanie jako składniki barwników, leków czy organicznych półprzewodników.
Od dawna trwały prace mające syntetycznie stworzyć jeszcze dłuższe cząsteczki. Heksacen po raz pierwszy wykryto w 1939 roku ale dopiero później wymyślono wydajne metody syntezy. Siedmiopierścieniowy heptacen otrzymano dopiero w 2006 roku, okta i nonacen w 2010 roku. W tym roku natomiast udało się otrzymać dziesięciopierścieniowy dekacen.[2] Zrobiono mu nawet "zdjęcie" przy pomocy mikroskopii tunelowej:

@ TU Dresden

Długie aceny stają się nietrwałe. Rezonans orbitali na tak długiej cząsteczce powoduje pojawianie się reaktywnych struktur rodnikowych, dlatego  zazwyczaj udawało się otrzymywać aceny odpowiednio podstawione.

Ultralekkie aluminium?
Badacze z Rosji donieśli ostatnio o możliwości stworzenia formy glinu o nietypowych właściwościach. Metastabilna, ultralekka forma tego metalu miałaby gęstość zaledwie 0,61 g/cm3, co oznacza, że pływałaby po wodzie i była niewiele cięższa od litu. Odkrycia dokonano metodami obliczeniowymi, więc jest to raczej możliwa struktura niż faktycznie otrzymanie takiego metalu fizycznie. Trudno powiedzieć czy rzeczywiście da się taką odmianę otrzymać.
W zaproponowanej strukturze cztery atomy glinu tworzą małe czworościany, trochę podobne do tych ze struktury białego fosforu, które łączyłyby się poprzez każdy z atomów z czterema innymi takimi czworościanami. Ze względu na geometrię czworościanów ich układ w komórce elementarnej odpowiadałby strukturze diamentu, co nadawałoby metalowi wytrzymałość. Niska gęstość wynika wówczas stąd, że w diamentopodobnej strukturze pojawiają się niewypełnione luki rozmiaru kilku atomów. [3]

-----
[1] William A. Donald et al.  Highly Charged Protein Ions: The Strongest Organic Acids to Date, Angew. Chem. Int. Ed. Volume 56, Issue 29 July 10, 2017 Pages 8522–8526
[2] https://tu-dresden.de/tu-dresden/newsportal/news/wissenschaftler-der-tu-dresden-und-des-ciqus-entwickeln-decacen-das-laengste-acen-das-je-hergestellt-wurde?set_language=en
[3]  Iliya V. Getmanskii, Vitaliy V. Koval, Ruslan M. Minyaev, Alexander I. Boldyrev, Vladimir Isaak Minkin. Supertetrahedral Aluminum - a New Allotropic Ultra-Light Crystalline Form of Aluminum. The Journal of Physical Chemistry C, 2017;

Skąd ten akrylamid?

Co jakiś czas media donoszą o wykryciu tego związku chemicznego w różnych produktach, a to w chipsach, a to w prażonych orzeszkach a to znów w ciasteczkach czy solonych paluszkach. To silna trucizna o działaniu rakotwórczym. I wówczas może was zastanowić, skąd się właściwie w jedzeniu ten akrylamid wziął. Specjalnie go dodają? Czy może sam powstaje?

Chemicznie rzecz ujmując, akrylamid to amid kwasu akrylowego, związek nienasycony zawierający wiązanie podwójne, grupę karbonylową i aminową. Każda z tych grup składowych może wchodzić w różnorodne reakcje, toteż cząsteczka będąca najściślejszym z możliwych ich połączeniem musi być bardzo reaktywna. Na tyle, że po dostaniu się do organizmu reaguje z białkami, lipidami i DNA wywołując różnorodne rozproszone uszkodzenia. Podczas metabolizmu jest utleniany przez komórkowy cytochrom 450 do formy epoksydowej czyli glicydamidu, który jest cząsteczką jeszcze bardziej reaktywną.

Glicydamid

Jako silny środek alkilujący działa mutagennie mogąc wywoływać nowotwory. W modelach zwierzęcych przewlekła ekspozycja na akrylamid w wysokich stężeniach, wywoływała nowotwory nadnerczy, tarczycy, płuc i jąder, oraz działała toksycznie na układ nerwowy.

Związek ten odkryto już bardzo dawno. Ze względu na skłonność do polimeryzacji zaczął być używany do produkcji tworzyw sztucznych o specjalnym przeznaczeniu. Polimeryzacja w roztworze wodnym tworzy twardy hydrożel o dużej przepuszczalności, będący jednym ze standardowych materiałów w elektroforezie białek i DNA. Ponadto używano go jako składnika różnych polimerów, substratu do produkcji pestycydów czy barwników. Przez długi czas wydawało się więc, że jedynym problemem toksykologicznym jest zanieczyszczenie środowiska przez zakłady które go używały, przenikał bowiem do ścieków a stamtąd do wody. Dlatego zaskoczeniem było odkrycie w 2002 roku, że w wyniku specyficznej reakcji może powstawać także w żywności.

Erytryjska badaczka Eden Tareke, zatrudniona na wydziale chemii żywności Uniwersytetu Sztokholmskiego, wprowadzała nową bardziej dokładną metodę badania żywności. Podczas testów z różnymi próbkami zauważyła niepokojący poziom akrylamidu w chipsach ziemniaczanych. Wydawał się zbyt duży aby wytłumaczyć to zanieczyszczeniami przemysłowymi. Wykonała więc prosty eksperyment - przygotowała chipsy z ziemniaków, które wcześniej przebadała pod kątem zawartości akrylamidu. Chipsy smażone w temperaturze przekraczającej 120 stopni nabierały wysokich poziomów akrylamidu, którego nie było w ziemniakach. A więc musiał on w jakiś sposób podczas smażenia powstawać. [1]

Kluczem okazała się znana od dawna reakcja Maillarda. W rzeczywistości jest to zespół reakcji o podobnym przebiegu, podczas których cukry redukujące reagują z aminami w podwyższonej temperaturze. Powstałe produkty ulegają izomeryzacji, dekarboksylacji, dehydratacji, kondensacji itp. w najrozmaitszych możliwych kombinacjach. 20 aminokwasów i jeden cukier redukujący tworzą setki produktów. W żywności zachodzą podczas każdej termicznej obróbki produktów zawierających białka i węglowodany, a więc podczas pieczenia, smażenia, duszenia czy wędzenia; podczas gotowania w mniejszym stopniu.
Powstałe wielkocząsteczkowe produkty kondensacji odpowiadają za brązowy kolor dobrze podpieczonego jedzenia, natomiast te mniejsze wpływają wyraźnie na smak i zapach. Większość składników aromatu pieczonego mięsa, pieczonego chleba czy prażonych ziaren kawy to właśnie produkty reakcji Mailarda, są więc niezbędne aby żywność nabrała pożądanych właściwości smakowych. Jak się jednak okazało, nie każde z możliwych reakcji są dobre.

W jednej z możliwych dróg grupa aminowa aminokwasu reaguje z grupą aldehydową cukru redukującego, a więc na przykład glukozy. Powstaje przejściowy produkt w którym dwie części połączone przez azot zawierają grupę karboksylowa i hydroksylową w pobliżu tego połączenia. W wysokiej temperaturze następuje odszczepienie cząsteczki wody i powstanie iminy w formie zasady Schiffa. Ta z kolei dekarboksyluje odszczepiając cząsteczkę dwutlenku węgla. Powstały nietrwały produkt bądź rozpada się z wytworzeniem podwójnego wiązania, bądź hydrolizuje. Jednym z produktów ostatecznych jest akrylamid. Ze względu na budowę najlepszym substratem do reakcji jest aminokwas asparagina, zaś cukrem redukującym jest najczęściej glukoza występująca w formie wolnej lub powstająca w wyniku rozpadu skrobi.[2]
W odpowiednio wysokich temperaturach możliwa jest też formacja bez cukrów, z gliceryny towarzyszącej tłuszczom. Gliceryna utlenia się do akroleiny, będącej aldehydem; ta reaguje z wolnymi aminami i w podobny sposób jak opisane wcześniej reakcje, zamienia się w akrylamid.
Reakcje te wymagają odpowiedniej temperatury, zaczynają ruszać w temperaturach powyżej 120 stopni i w większości produktów zachodzą najwydajniej około 140-150 stopni.

Największe stężenia wykrywa się w takich produktach jak frytki, chipsy ziemniaczane, mocno palona kawa, kawa rozpuszczalna, przypalone tosty, prażone orzechy. Ogółem są to zatem połączenia typu "skrobia + białko". Ważnym źródłem jest też dym papierosowy i dym ze spalania śmieci w niskich temperaturach.

Toksyczność
Jak już wspominałem, w badaniach na zwierzętach wykazano, że ekspozycja na akrylamid wywołuje różnego rodzaju nowotwory. Tymczasem w przypadku ludzi wpływy są najwyraźniej dużo subtelniejsze i trudne do precyzyjnego wyrażenia. Jak wracają uwagę krytycy, w badaniach na zwierzętach efekty kancerogenne pojawiały się przy stężeniach wielokrotnie większych niż spotykane w jedzeniu i ciężko jest je przełożyć na skutki dla ludzkiego organizmu. Zakładając liniową zależność prawdopodobieństwa dodatkowych nowotworów od stężenia, przy przeciętnej diecie wzrost ryzyka staje się tak mały, że mniejszy niż wpływ narażenia na dym.

Badania populacyjne osób narażonych na tą substancję w jedzeniu są niejednoznaczne. Chętnie spożywający chipsy i frytki mają zwiększoną częstość różnych chorób, ale ciężko przypisać to wyłącznie temu składnikowi a nie spożyciu tłuszczów, nadmiaru soli czy narażeniu na utlenione nienasycone kwasy tłuszczowe. Badania pracowników narażonych w pracy na akrylamid w większych niż w żywności stężeniach dawały różne wyniki, od większej częstości chorób po brak efektu. Ze względu na to, że stykamy się z nim od początków gatunku, gdy tylko zaczęliśmy piec mięso mamutów nad ogniskiem, możliwe że wykształciliśmy sobie jakiś sposób detoksyfikacji. Dlatego też formalnie składnik ten jest klasyfikowany jako substancja podejrzewana o rakotwórczość u ludzi.[3]
Przesadne są więc internetowe artykuły straszące szybkimi skutkami zdrowotnymi i wysoką toksycznością, czy opinie w rodzaju "zjadłem smażeninę, od razu rozbolała mnie głowa, to przez akrylamid". No nie, raczej od okazjonalnego zjadania czegoś mocno podpieczonego wiele się nam nie stanie, niemniej warto pamiętać o tym, że pewne trudne do określenia ryzyko faktycznie jest. I wobec tego może jednak trochę się ograniczyć ze spożywaniem czegoś przypalonego, podpieczonego do ciemnego brązu czy podprażonego. 

Redukcja
Czy da się tak produkować żywność, aby z jednej strony nie utracić wartości smakowych a z drugiej zredukować poziomy akrylamidu do możliwie najniższych wartości? Da się, i to na kilka różnych sposobów. Zauważono na przykład, że reakcji w której powstaje sprzyjają sole amonowe, w związku z czym więcej jest go w ciasteczkach w których jako spulchniacza użyto amoniaczku (węglan amonu) niż proszku do pieczenia (wodorowęglan sodu), można więc zastąpić jeden spulchniacz innym i zauważalnie zmniejszyć zawartość niepożądanego składnika.
Innym czynnikiem hamującym są sole zawierające kationy dwudodatnie, w przypadku pieczywa możliwe jest więc wzbogacenie ciasta w sole wapnia. Kolejny inhibitor to aminokwas glicyna. Ma on najprostszą możliwą budowę, tylko dwa węgle w cząsteczce. Ulega reakcji Maillarda ale nie może zamienić się w akrylamid. Wzbogacenie glicyną pierwotnego produktu przed obróbką termiczną powoduje, że część wolnych cukrów redukujących łączy się z nią zamiast z innymi aminokwasami co zużywa niezbędny substrat. Ma to jednak tą wadę, że produkty reakcji z glicyną powodują dużo mocniejsze zbrązowienie oraz niekiedy niepożądany posmak, więc nie wszędzie da się ją zastosować.

Najbardziej oczywistym sposobem jest obniżenie temperatury tak aby nie przekraczała 120 stopni lub skrócenie czasu ogrzewania. (jeśli macie wrażenie, że w ostatnich latach ciastka kruche i herbatniki są jakby mało wypieczone, to możliwe że to jest tego przyczyną). W przypadku chipsów i frytek pewne znaczenie ma też branie do produkcji bulw krótko przechowywanych. Podczas przechowywania, w ziemniakach zachodzi proces rozpadu skrobi z powstaniem wolnej glukozy, będącej przecież cukrem redukującym. W skrajnych przypadkach długo przechowywane ziemniaki mogą się stać słodkawe w smaku.[4]
-------
*  http://www.efsa.europa.eu/en/topics/topic/acrylamide

[1] Eden Tareke et. al., Analysis of Acrylamide, a Carcinogen Formed in Heated Foodstuffs,
. Agric. Food Chem., 2002, 50 (17), pp 4998–5006

[2] Maria D. Villagran et al. Acrylamide Formation Mechanism in Heated Foods, J. Agric. Food Chem. 2003, 51, 4782−4787
[3]  https://www.cancer.gov/about-cancer/causes-prevention/risk/diet/acrylamide-fact-sheet
[4]  Guidance on reducing acrylamide in food, FDE

Poison Story (9.) - Błękitny kwiat

Miał to być kolejny szczęśliwy dzień. Lakhvinder Cheema wrócił z pracy do swojego domu w Feltham, zachodniej dzielnicy Londynu i odgrzewał potrawkę z kurczaka w sosie curry, zagadując do swojej narzeczonej Gurjeet. A mieli dużo do obgadania, zaledwie za dwa tygodnie, w Walentynki, zamierzali wziąć ślub, który przy okazji zalegalizuje pobyt narzeczonej w Anglii. Znali się dopiero od kilku miesięcy, ale byli zupełnie zdecydowani aby przeżyć ze sobą następne lata.

Potrawka podlana ostrym sosem smakowała mu tak bardzo, że zjadł podwójną porcję. Jednak gdy już kończył w znajome pieczenie w ustach wkradło się nietypowe wrażenie drętwienia i mrowienia. Zdziwiony dotknął palcem języka i ust stwierdzając, że zupełnie nic nie czuje.
- Źle się czuję - powiedział do narzeczonej. - To chyba coś w jedzeniu.
Próbował wstać, ale nogi się pod nim załamały. Gurjeet nie mogła mu pomóc, bo sama znalazła się w podobnym stanie. Poczuła zawroty głowy a światło w kuchni osłabło aż do zupełnych ciemności. Przezwyciężając osłabienie Cheema zadzwonił na pogotowie, dodając ostatkiem sił:
- Ktoś dodał truciznę do jedzenia. To moja była dziewczyna.
Zaledwie kilka minut później oboje byli już bezwładni a ich ciałami wstrząsały drgawki. Godzinę po przyjęciu do szpitala, Cheema zmarł, a Gurjeet musiała zostać podłączona do respiratora. Najważniejszym było teraz dociec jaka substancja wywołała tak gwałtowne skutki.
Jeszcze tego samego dnia policja zatrzymała Lakhvir Singh, byłą kochankę Cheema. Podczas przeszukania znaleziono przy niej torebeczkę z drobnym, roślinnym pyłem.
- To proszek na wysypkę - tłumaczyła. Początkowo jednak nie zbadano tego tropu. Objawy były tak gwałtowne, że sądzono, że to zatrucie cyjankiem potasu.

Singh poznała Lakhvindera dawno temu. Uwikłana w niezbyt szczęśliwe małżeństwo, możliwe że aranżowane, szybko zwróciła uwagę na młodego Sikha który zaczął wynajmować u nich pokój. Był świeżo po rozwodzie, samotny, nic więc dziwnego, że między nim a żoną najemcy zawiązała się bliższa zażyłość. Nawet gdy znalazł sobie inne mieszkanie i tak przychodziła do niego niemal codziennie, gotowała, sprzątała i sypiała z nim jak prawdziwa żona. Gdy mąż Singh zachorował na raka i musiał przejść długotrwałe leczenie, uznała to za dobrą okazję aby częściej bywać z kochankiem. W trakcie trwającego 16 lat romansu dwa razy zaszła w ciążę, którą na jego prośbę usunęła.
Ale w miarę upływu lat Cheema starał się od niej oddalić, będąc zmęczony jej zaborczym podejściem. W 2008 roku krewni zaczęli swatać go z o połowę młodszą Gurjeet Choongh, która niedawno przyjechała do Anglii. Od razu się sobie spodobali i szybko formalnie się zaręczyli. Odrzucona kochanka szalała ze złości, wysyłając mu nienawistne wiadomości. Mimo to jeszcze przez pewien czas przychodziła do jego domu, aż na początku grudnia Cheema powiedział dość.

Lakvinder Cheema i jego narzeczona Gurjeet Choongh

Zbadanie rodzaju trucizny pomimo zabezpieczenia proszku z kieszeni podejrzanej, porcji nie zjedzonego sosu curry i wymiocin ofiar, okazało się jednak dużo trudniejsze niż się to początkowo wydawało. Cyjanek szybko wykluczono. Ze względu na objawy sugerujące porażenie nerwów, brano pod uwagę neurotoksyczne pestycydy, ale mogły być to też trucizny roślinne. Trudno było choćby przybliżyć rodzaj substancji, dlatego analitycy postanowili użyć metody najbardziej ogólnej, która powinna wykrywać i zidentyfikować niemal wszystko - analizy chromatograficznej sprzężonej ze spektrometrią mas.

Chromatografia to metoda rozdziału mieszanin oparta o różne powinowactwa składników mieszaniny do adsorbentu wypełniającego długi przewód lub kolumnę. Każda substancja, której roztwór lub opary są przepuszczane przez dobrze adsorbujący, porowaty materiał, w jakimś stopniu oddziałuje z jego powierzchnią. Siła tego oddziaływania zależy w dużym stopniu od tego jaka to jest cząsteczka, a więc jakie ma grupy funkcyjne, jaki ma moment dipolowy, hydrofilowość, rozmiar cząsteczki itp. Jedne będą więc mocniej się wiązały z wypełnieniem a inne słabiej. Podczas przepuszczania porcji mieszaniny substancji przez kolumnę z odpowiednim wypełnieniem, te najsłabiej z nim oddziałujące substancje będą najefektywniej wymywane przez rozpuszczalnik, wypierane przez mocniej oddziałujące i w efekcie oddzielą się jako osobna porcja, podróżująca przez kolumnę szybciej, na przedzie.

Chromatografia wyciągu z zielonego liścia na płytce pokrytej warstwą adsorbentu. Od góry: karoten, feofityna, karotenoidy, chlorofil a i b

Sumą tych wszystkich procesów powinno być zatem pooddzielanie składników mieszaniny i możliwość zbadania czystych. Jednakowoż oddzielenie i oczyszczenie składnika mieszaniny, niczego nam o nim nie mówi, dlatego dla identyfikacji wykorzystuje się inny skutek wyżej opisanych procesów - dla danej substancji w danych warunkach czas przejścia przez kolumnę z określonym rodzajem wypełnienia jest taki sam.
Jeśli więc najpierw przepuścimy przez kolumnę mieszaninę, rejestrując detektorem pojawianie się kolejnych składników i czasy ich przebiegu, a potem, nie zmieniając warunków, małe ilości wzorców substancji których obecności się w mieszaninie spodziewamy, to stwierdzenie, że pewne składniki miały identyczny czas przebycia co dany wzorzec jest równoznaczne z potwierdzeniem, że są to te same substancje.

No dobrze. A co w przypadku gdy nie wiemy nawet jakiego użyć wzorca, bo morderczyni użyła trudno powiedzieć jakiej trucizny? Tutaj z pomocą przychodzi dołączenie do zestawu chromatograficznego detektora, który prócz wykrycia, że dotarł do niego rozdzielony składnik mieszaniny, może nam coś o nim powiedzieć - analizatora przy spektrometrii mas.

Spektrometria mas to metoda bardziej bezpośredniego badania składu substancji. Zasada działania jest generalnie bardzo prosta - jeśli zjonizujemy badaną substancję i poddamy otrzymane jony działaniu pola elektrycznego, to będą się w nim poruszać nabierając pewnego pędu. Jony o tym samym ładunku ale różnej masie w tym samym polu zyskają różny pęd. Możliwe jest zbudowanie takiego układu, w którym następować będzie odsiewanie jonów o niepasującej masie. Może to być na przykład rurka skręcająca pod ostrym kątem, w której układ magnesów tworzy kanał zaginający jony. Jony lekkie będą zbyt silnie zaginane i uderzą w ściankę, te zbyt ciężkie  nie będą się wyrabiały na zakręcie i też uderzą w ściankę. Zmieniając moc magnesów możemy zmieniać optymalny zakres mas w którym jony są w stanie przejść przez układ filtrujący. W efekcie z wiązki jonów najpierw zarejestrowane zostaną te o jednej masie a potem te o innej.
Wiedząc jak zmienialiśmy parametry układu filtrującego możemy zatem określić jaką dokładnie masę cząsteczkową musiały mieć jony które w danym momencie, po przejściu przez układ uderzyły w detektor i zostały wykryte. Szybkie przemiatanie ustawieniami analizatora po zjonizowaniu próbki da nam widmo masowe jonów powstałych z danej substancji, a to jest już w stanie powiedzieć nam coś o tym z jaką konkretnie substancją mamy do czynienia.

Zależnie od metody i siły jonizacji analizuje się bądź masy jonów pojedynczych cząsteczek, bądź masy jonów pochodnych, bowiem przy dużej energii jonizacji cząsteczka rozpada się na fragmenty. Przy dużej dokładności określenia masy możliwe jest odróżnienie różnych jonów o zdawałoby się tej samej masie molowej, w oparciu o różnice na trzecim czy czwartym miejscu po przecinku i dodatkowe sygnały od izotopów. Dla większego ułatwienia analizy oprogramowanie aparatów MS zwykle zawiera bibliotekę znanych widm masowych, z którą można porównać wyniki.

No dobra - mamy więc zestaw analityczny. Teraz tylko kwestia dobrania warunków i sprawdzenia czy wyniki zgadzają się z czymś nam znanym. Początkowo użyto techniki chromatografii gazowej, w której rozdział następuje w długiej kolumnie przez którą przepuszcza się gaz obojętny, a próbka jest odparowywana na małej grzałce, jednak ten sposób nie dał żadnych ciekawych wyników. Najprawdopodobniej użyta toksyna była mało lotna lub rozkładała się przy odparowaniu próbki.
Musiano więc przestawić się na technikę chromatografii cieczowej, z próbką rozpuszczaną w odpowiednim rozpuszczalniku. Jest to metoda o tyle gorsza, że do roztworu przechodzi dużo przeszkadzających substancji.

Dopiero teraz dało się wyłapać charakterystyczny sygnał, który pojawiał się we wszystkich trzech próbkach - roślinnym proszku, sosie curry i próbkach pobranych od otrutych. Widmo masowe pokazało stosunkowo dużą masę cząsteczkową, leżącą w zakresie w którym pojawia się wiele alkaloidów roślinnych. Po porównaniu masy głównego jonu i fragmentów cząsteczki z biblioteką zarejestrowanych widm nie otrzymano konkretnego wyniku - widocznie było to trucizna na tyle rzadko spotykana, że nie zapisano jej analiz. Jednak analiza zarejestrowanych fragmentów i wiedza na temat tego w jaki sposób przejonizowane cząsteczki rozpadają się w spektrometrze, pozwoliła dojść analitykom do wniosku, że musi być to któraś z toksyn z grupy akonityn.
Skrupulatne przejrzenie literatury doprowadziło badaczy do najbardziej prawdopodobnego wyniku - pseudoakonityny, toksyny z rosnącej w Indiach rośliny z rodzaju tojad, której europejski odpowiednik jest też znany jako ogrodowa roślina ozdobna. Aby potwierdzić przypuszczenia, laboratorium poprosiło ogród Kew Gardens o próbki roślin.

Tojad mocny, nazywany też mordownikiem, jak to wprost nazwa sama wskazuje jest rośliną silnie trującą. Należy do rodziny jaskrowatych, konkretnie plemienia Delphinieae, wraz z ostróżką i ostróżeczką. Jest byliną o charakterystycznych, głęboko podzielonych liściach i ukwieconym pędzie dorastającym do półtora metra wysokości. Kwiaty duże, intensywnie granatowe z charakterystycznym "hełmem" z przerośniętego piątego płatka. Z tego też powodu nazywany był także błękitnym lub mnisim kapturem. Występuje w Europie głownie na terenach górskich i pogórzu, kilka stanowisk znanych jest z polskich Karpat. Bardziej rozpowszechniony jest tojad mołdawski, rosnący też na wyżynach i w dolinie Wisły. Pojedyncze stanowiska na nizinach to głównie wynik ucieczki z ogrodów.
Ze względu na bardzo efektowny wygląd i intensywną barwę, tojad jest uprawiany jako roślina ozdobna. Wiele osób może go mieć u siebie nie wiedząc z jak niebezpieczną rośliną mają do czynienia, wyhodowano liczne odmiany o kolorach białym czy różowym, z plamkami czy jasnym obrzeżeniem. Jest uważana za jeden z klasycznych kwiatów tradycyjnego angielskiego ogrodu.

Właściwości tojadu poznano już bardzo dawno. Wedle mitologii greckiej miał powstać w miejscu, gdzie na ziemię spadła ślina Cerbera, demonicznego psa pilnującego wejścia do Hadesu. Czarodziejka Medea miała zatruć tojadem wino przeznaczone dla Tezeusza, gdy ten zażądał należnego mu tronu. Atena użyła tej rośliby aby zamienić dumną Arachne w pająka. Przypuszcza się, że posłużyła do otrucia cesarza Klaudiusza, któremu podano zatrutą potrawę z grzybów, przy czym szybkie pojawienie się objawów i drętwienie języka nie bardzo pasowały do trujących grzybów; podobne podejrzenia dotyczą śmierci jego syna Brytanika. W późniejszych wiekach zyskała sławę "roślinnego arszeniku".
Ludy zamieszkujące Syberię, Kazachstan i Kamczatkę, oraz Ajnowie będący pierwotnymi mieszkańcami północnych wysp archipelagu japońskiego, używały soku z tojadu do zatruwania strzał i wnyków podczas polowania na niedźwiedzie czy łosie.

Podobnie jak inne silnie trujące rośliny, tojad był dawniej używany w medycynie. Skoro bowiem toksyna działa na organizm tak silnie, to w odpowiednio dobranej dozie powinna być silnie lecznicza. Medycyna europejska stosowała tojad i preparaty pochodne jako środek pobudzający czynności organów. W bardzo małych dawkach wskutek podrażnienia zakończeń nerwowych poprawiała pracę układu pokarmowego i krążenie, równocześnie uspokajając pracę serca. Wyciągi użyte zewnętrznie powodowały porażenie nerwów czuciowych a co za tym idzie lokalne znieczulenie. Używano go jednak ostrożnie, bowiem naturalny surowiec posiadał mocno zmienną zawartość toksyny i trudno było precyzyjnie dobrać dawkę.[1]
W medycynie chińskiej i ayurwedyjskiej lokalne gatunki tojadu są środkiem rozgrzewającym i zwiększającym poziom energii w nerkach, stąd też chętnie używany w przewlekłych chorobach związanych ze starością, których przyczyną miało być "wychłodzenie" i gromadzenie się "wilgoci". Roślina musiała być w tym celu odpowiednio przygotowana aby obniżyć jej toksyczność. Najczęściej brano pojawiające się jesienią bulwki korzeniowe i bardzo długo gotowano, przez co toksyna bądź częściowo rozkładała się, bądź była wymywana. Gorzkie w smaku bulwki zawierają skrobię, dlatego lokalnie są spożywane po prostu jako warzywo. Łukasz Łuczaj miał okazję spróbować takiego właściwie przyrządzonego dania.[2]

Główną toksyną europejskiego tojadu jest akonityna, alkaloid o dość skomplikowanej, przestrzennej budowie:

Należy do najsilniejszych toksyn roślinnych, dawka śmiertelna czystej substancji to zaledwie 1 mg/kg m.c. ustnie dla myszy, dla człowieka szacowane LD 50 to 3-4 mg/kg. Dawka toksyczna przy podaniu dożylnym lub przezskórnym jest jeszcze niższa. Odpowiada to spożyciu około 2 gramów rośliny lub 20-30 ml nalewki. Najbardziej toksyczna jest jesienna bulwa korzeniowa oraz nasiona. Nie znalazłem informacji czy toksyna występuje też w płatkach kwiatów.
Jest stosunkowo dobrze wchłaniana przez skórę. Podczas prac ogrodowych trzeba pamiętać aby nie pobrudzić skóry sokiem z łodyg, powoduje bowiem pieczenie a potem znieczulenie, może nawet miejscowe zdrętwienie.  W 2014 roku ogrodnik pracujący w rezydencji milionera Christophera O. Thompsona stracił przytomność. Po przewiezieniu do szpitala zmarł z powodu ustania czynności narządów. Po kilku tygodniach pojawiło się podejrzenie, że mógł zatruć się tojadem, który w tym czasie kwitł. Prawdopodobnie ścinając rośliny z rabaty, pobrudził ręce dużą ilością soku, dalej toksyna bądź wchłonęła się przez skórę bądź została połknięta z jakąś kanapką. Ostatecznie nie udało się tej wersji potwierdzić, bo możliwość taką zgłoszono już po pogrzebie, gdy próbki krwi były już zutylizowane. [3]

Działanie toksyczne akonityny wynika z zaburzenia działania komórek nerwowych. Przeciętna komórka nerwowa utrzymuje we wnętrzu  nierównowagę ilości jonów, wyrzucając je za pomocą kanału jonowego tzw. pompy sodowo-potasowej. Jest to baryłkowaty twór ze splecionych łańcuchów białkowych, który przechodzi na wylot przez błonę komórkową. Wyrzuca on na zewnątrz dodatnio naładowane kationy sodu, przez co na błonie powstaje niewielki ładunek ujemny. Impuls nerwowy powstaje gdy kanał jonowy otworzy się, a kationy sodu napływają do komórki. Potencjał elektryczny błony najpierw staje się zerowy (depolaryzacja) a potem na krótko dodatni. Potem kanał się zamyka i w ciągu następnych kilku mikrosekund pompa wyrzuca kationy sodu na zewnątrz, przywracając pierwotny potencjał. Powstały w ten sposób impuls zmiany potencjału rozchodzi się od neuronu do neuronu, generując przepływ informacji i umożliwiając między innymi czytanie tego tekstu.

Kanały jonowe generujące impulsy mogą być otwierane dzięki czynnikom chemicznym które łączą się z odpowiednimi receptorami białkowymi mającymi połączenie z takim kanałem. Naturalne takie substancje to neuroprzekaźniki, zaś te sztuczne to najczęściej substancje pobudzające i psychoaktywne.
Akonityna po dostaniu się do organizmu przyłącza się do białkowej podjednostki alfa kanałów jonowych i powoduje, że po otwarciu takiego kanału, jego zamknięcie następuje później niż zwykle. Skutkuje to przedłużeniem fazy depolaryzacji. Jeśli wiele takich kanałów na powierzchni komórki nerwowych zostało obsadzonych przez cząsteczki akonityny, faza depolaryzacji może trwać tak długo aż neuron przestanie wysyłać i odbierać impulsy. Jeśli zaś z kolei tych niemych neuronów będzie w organizmie odpowiednio dużo, to zatrzymanie impulsów zatrzymuje pracę narządów.
Hamowanie impulsów w nerwach obwodowych skutkuje osłabieniem pracy mięśni. Dalej pojawia się porażenie mięśnia sercowego. Działanie na mózg wywołuje brak odbioru wrażeń zmysłowych. Nieskoordynowane próby odnowienia aktywności mózgowej kończą się drgawkami, zaburzeniami oddychania i krążenia. Ostatecznie śmierć następuje po ustaniu oddechu lub pracy serca, prawdopodobnie przy zachowanej świadomości.
To zdecydowanie nie jest przyjemna śmierć.

W przypadku zatrucia pokarmowego leczenie polega na zapobiegnięciu dalszego wchłaniania trucizny, poprzez płukanie żołądka i podanie węgla aktywnego.  Należy sztucznie podtrzymywać oddech a czasem też pracę serca, do czasu aż receptory nie zostaną odblokowane a toksyna usunięta. Odtrutką specyficzną jest atropina, alkaloid bielunia, która ma na komórki nerwowe działanie przeciwne.

Jak wspomniałem, tojad należy do rodziny jaskrowatych a konkretnie do "plemienia" Delphinieae. Do tej samej grupy należy inny popularny kwiat ostróżka, oraz częsty chwast polny ostróżeczka. Obie te rośliny także mogą zawierać substancje o podobnej budowie, głównie metyllykakonitynę. Toksyna ostróżki ma działanie kilkukrotnie słabsze od akonityny a ponadto występuje w dużo mniejszej ilości. Ze względu na działanie na receptory nikotynowe była testowana jako środek pomagający rzucenie palenia, ma ponadto działanie przeciwstawne do cannabioidów. Wyciągi z ostróżki są czasem stosowane w "ekologicznych" opryskach przeciwko bielinkowi kapustnemu i innym owadom będącym szkodnikami warzyw.
Z kolei ostróżeczka polna, będąca chwastem, i uprawiana jako ozdobna ostróżeczka ogrodowa zawierają niewielką ilość alkaloidów, które od dawna są wykorzystywane w preparatach przeciwko wszom i pchłom.

Jak skończyła się sprawa o otrucie Cheema?
Gdy już dowiedziono, że użytą trucizną był tojad, pozostawało tylko udowodnić Lakhvir Singh winę. Znaleziono przy niej roślinny proszek będący sproszkowanym indyjskim gatunkiem tojadu Aconite forex, zawierającym pseudoakonitynę, a więc ten sam alkaloid który ostatecznie po długich badaniach udało się wykryć w próbkach od zatrutych. Ona sama tłumaczyła jednak, że to używane przez nią zioła i że niczego byłemu narzeczonemu nie dosypywała.
Sprawdzono skąd mogła mieć proszek - kilka tygodni wcześniej była na krótko w Indiach, tam kupienie większej ilości nie nastręczało żadnych trudności. Zeznania Gurjeet, którą ostatecznie udało się odratować, także dużo wniosły. Próby definitywnego zakończenia poprzedniego związku były dość burzliwe. Singh jeszcze wielokrotnie przychodziła do domu byłego kochanka, robiąc mu awantury i strasząc, że załatwi deportację jego narzeczonej. W międzyczasie wyszło na jaw, że Cheema oszukiwał narzeczoną, mówiąc jej że rozstał się z panią Singh trzy lata temu i teraz są tylko przyjaciółmi. Była zaskoczona gdy dowiedziała się, że jeszcze niedawno spędzała u niego wolne dni. W Boże Narodzenie 2008 narzeczeni uczestniczyli w spotkaniu towarzyskim, na którym znalazła się też Singh. Gurjeet próbowała po przyjacielsku załatwić sprawę mówiąc jej, że wie o wszystko o ich wieloletnim romansie i radziła jej, że powinna jednak mimo wszystko zająć się mężem i trójką dzieci. To jednak nie poskutkowało.
  Na początku stycznia 2009 Singh znów przyszła do domu kochanka, robiąc awanturę o to, że narzeczeni już ze sobą śpią choć nie mają ślubu. Wiedziała to bo zakradła się pod dom i podglądała ich przez okno. Dwa tygodnie później narzeczeni zatruli się sosem curry.

Kolejną zastanawiającą okolicznością było wcześniejsze zatrucie. Cheema zatruł się na początku grudnia potrawką warzywną i kilka dni spędził w szpitalu. Stało się to kilka dni po poważnej rozmowie, podczas której odtrącił Singh. Już wtedy podejrzewał, że dodała mu czegoś do jedzenia, ale zbagatelizował sprawę, bo w końcu zatrucie nie było silne.
Za dowód rozstrzygający uznano jednak zeznania dwóch lokatorów Cheemy, którzy po południu w dniu tragicznego zdarzenia, widzieli jak Singh przyszła do domu byłego kochanka, otwierając sobie własnymi kluczami. Nie bardzo się orientowali jak to między nimi ostatecznie było i jak się dogadali, a ponieważ widywali ją już wcześniej, nie widzieli niczego podejrzanego w tym, że skierowała się do kuchni i zaglądała do lodówki.

Na początku 2010 roku Lakhvir Singh została skazana na dożywocie z  możliwością przedterminowego zwolnienia dopiero za 23 lata. O tym jak wyjątkowy i rzadki jest to przypadek świadczy to, że poprzedni wyrok w sprawie o otrucie tojadem zdarzył się w Wielkiej Brytanii w roku 1892.
---------------------------------
Źródła:
[1]  http://www.independent.co.uk/news/uk/home-news/gardener-dies-after-brushing-against-deadly-wolfsbane-flower-on-millionaires-estate-9845675.html
[2]  http://rozanski.li/278/tojad-mocny-aconitum-napellus-l-ranunculaceae-jak-to-dawniej-z-nim-bylo-w-medycynie/
[3] http://lukaszluczaj.pl/tojad-lek-pozywienie-i-trucizna-w-jednym/

* https://www.chemistryworld.com/feature/its-a-bloody-business/8378.article
* http://akrokorinthos.blogspot.com/2013/11/the-poison-aconite-or-wolfsbane.html
*  https://en.wikipedia.org/wiki/Aconitine
* https://en.wikipedia.org/wiki/Methyllycaconitine
*  http://murderpedia.org/female.S/s/singh-lakhvir.htm