Barwienie bakterii metodą Grama

Dawno, dawno temu, kiedy jeszcze uczyłem się w technikum chemicznym, jednym z przedmiotów była bioanaliza, gdzie uczyliśmy się jak badać mocz, rozpoznawać pod mikroskopem różne limfocyty, albo badać zawartość cholesterolu w osoczu.
Jednym z ciekawszych ćwiczeń była hodowla bakterii z powietrza - sterylną płytkę z podłożem odkrywało się na określony czas w nieruchowym powietrzu pomieszczenia, zakrywało i wstawiało do inkubatora. Bakterie które znajdowały się w powietrzu osiadały na płytce i tworzyły kolonie - jedna bakteria tworzyła jedną kolonię. Zliczając ilość kolonii na powierzchni płytki i znając czas wystawienia płytki, można było policzyć stężenie bakterii w powietrzu - całkiem proste.

Jednak otrzymane bakterie dobrze jest też jakoś zidentyfikować. Oprócz opisanych już kiedyś metod hodowli na podłożu różnicującym, inną techniką jest barwienie metodą Grama. Badanie obejmuje kilka etapów, a wszystkie je sfotografowałem.

Zasadnicza różnica między typami bakterii jaką wykrywa się w tym badaniu, to grubość i przenikliwość ściany komórkowej - w jednym bakteriach jest cienka, w innych stosunkowo gruba. Ma to wpływ na ogólną fizjologię bakterii, zaś dla medycyny znaczenie ma różna wrażliwość na leki - zasadniczo bakterie o grubszej ścianie komórkowej są bardziej odporne, z powodu słabszego wchłaniania antybiotyku do wnętrza. Różna grubość ścian komórkowych wykrywana jest przez selektywne wybarwianie fioletem krystalicznym. W jaki sposób?

Na początek należy sobie wybrać jakąś kolonię z której będziemy robić rozmaz:

Ja akurat wybrałem sobie taką w której na kolonię żółtą naciekała biała, mając nadzieję że uda mi się złapać dwa różne typy. Masę kolonii pobierałem ezą, to jest pętelką z drutu z rączką. Tę jednak należało przedtem wyżarzyć, aby usunąć wszystkie inne bakterie:

Ponieważ kolonia miała postać stałej masy, najpierw nabrałem nieco soli fizjologicznej:

potem nieco kolonii:

i rozmazałem na płytce:

Rozmaz należało teraz wysuszyć i utrwalić, aby bakterie dobrze przylegały do podłoża. Dlatego po podsuszeniu w suszarce przeciągnęliśmy płytki nad płomykiem lampki spirytusowej, tak aby masa bakteryjna "przyschła" do płytki.

Wszystkie płytki należało teraz umieścić nad tacką, założyć rękawiczki i uważać na ubranie, bo można się było nieźle pobrudzić. Najpierw każda płytka została zalana roztworem fioletu krystalicznego:

Następnie czekaliśmy dwie minuty, po czym zlaliśmy barwnik do tacki:

Nie usuwając całej cieczy, zalewaliśmy płytki płynem Lugola - na powierzchni płynu powstawała błyszcząca warstewka, jak podejrzewam był to wydzielający się jod. Płyn dzięki temu błyszczał i opalizował, wyglądając jak odwłok złotego żuka:

Po około trzydziestu sekundach zlaliśmy ciecz i dokładnie przemyliśmy alkoholem:

A następnie wodą:

Na sam koniec zalaliśmy płytki roztworem fuksyny:

Pół minuty potem zlaliśmy ją do tacki, płytki przemyliśmy wodą i osuszyliśmy w suszarce. Tak zabarwione płytki nadawały się do badania mikroskopowego:

Co takiego następowało podczas wybarwiania? Gdy zalewaliśmy płytki roztworem fioletu krystalicznego, wnikał on do bakterii zabarwiając je wszystkie. Dodany potem roztwór jodu dodatkowo przyciemniał zabarwienie poprzez tworzenie kompleksów jodu z barwnikiem. Na tym etapie zabarwione były wszystkie.
Jednak gdy przemywaliśmy płytki alkoholem, zaznaczyła się różnica - łatwo wypłukiwał on barwnik z bakterii o cienkiej ściance, natomiast nie był w stanie odbarwić bakterii o ścianie grubej. W efekcie te pierwsze stawały się bezbarwne, zaś te drugie ciemnofioletowe. Gdy zalaliśmy płytki fuksyną, odbarwione bakterie o cienkiej ścianie zabarwiły się na różowo. Te o grubej także, ale mocniejszy kolor fioletu zagłuszał róż.
W efekcie bakterie o ściance cienkiej zabarwiły się na różowo a te o grubej na ciemno fioletowo. Rożróżnianie bakterii pod mikroskopem jest zatem bardzo łatwe - bakterie Gram+ są fioletowe a Gram- różowe.

Akurat mnie, jako chemika-estetę bardziej zainteresowały kryształy fuksyny, które wykrystalizowały na płytce. Tutaj pęk kryształów w otoczeniu bakterii gram-ujemnych (powiększenie ok. 400X):

A tutaj w otoczeniu gram-dodatnich (pow. ok. 600X):

I na koniec mieszanka dwóch różnych typów bakterii: