Paramedycy kochają In Vitro

Wydawałoby się, że głównym problemem z medycyną alternatywną, naturalną czy niekonwencjonalną, jest ignorowanie osiągnięć nauki. Jednak przeglądając tego typu portale odnoszę często odmienne wrażenie. Ich problemem jest także powoływanie się na osiągnięcia naukowe. Tylko że źle zrozumiane.

  Jedną z takich charakterystycznych sytuacji daje się zauważyć na portalach i blogach dietetycznych, zdrowotnych czy zielarskich, które co i rusz donoszą, że oto właśnie odkryto, że "x leczy raka/odchudza/odmładza/zwiększa inteligencję" i przypadkiem właśnie to x można kupić jako suplement.
  I jeżeli artykuły takie powołują się na jakieś prawdziwe badania (powoływanie się na zasadzie: rosyjscy naukowcy, nie podamy jacy, odkryli, nie podamy jak, że x leczy y, ale nie powiemy skąd to wiemy - się nie liczy) to zazwyczaj są to bardzo podstawowe badania, w których nie badano rzeczywistego wpływu na chorego pacjenta, tylko na jego kawałek. A konkretnie na preparat wyizolowanych komórek, umieszczonych w szklanym naczyniu i potraktowanych jakimś roztworem. Jako że zaś szkło zwie się po łacinie "vitrum", a naukowcy chętnie wszystko latynizują, badanie takie nazywa się eksperymentem in vitro*.

  Badania na izolowanych komórkach stanowią jedną z najbardziej podstawowych technik biomedycznych, służących do zbadania wpływu biologicznego interesującej nas substancji. Jeśli działa ona poprzez wpływ na enzym, receptor czy jakąś część komórki, to efekty powinny być możliwe do zauważenia i zmierzenia już w tak bardzo uproszczonym modelu. W ten sposób testuje się na przykład efekty toksyczne czy mutagenne, sprawdza się aktywność substancji przeciwwirusowych czy selektywnych blokerów receptorów.
  Ostatnio coraz częściej testami na komórkach, ich wyhodowanych warstwach czy fragmentach skóry pobranych od dawców, zastępuje się testy kosmetyków na zwierzętach.  Są więc w nauce ważne, ale przy interpretacji wyników trzeba pamiętać, że jednak mimo wszystko dotyczą dość specyficznej sytuacji. Opierają się o uproszczony model działania na organizm, a modele takie zazwyczaj mają swoje ograniczenia.

  Bierze więc nasz badacz preparat komórek chorobowo zmienionych, dzieli na wiele małych próbek i traktuje różnymi stężeniami badanej substancji, powiedzmy wyciągu z czosnku albo może pochodnej dinitrofluorenometoksybenzochinonu. Po inkubowaniu w kontrolowanych warunkach dodaje do próbek wskaźnik żywotności, aktywności metabolicznej czy innych parametrów komórkowych, po czym sprawdza ile komórek wykazuje sygnał, w jakim stopniu wskaźnik uległ przemianie czy wchłonięciu.[1],[2] I otrzymuje wynik, że w próbce umieszczonej w próbówce, w roztworze takim a takim, po potraktowaniu badaną substancją, N % komórek wykazało zmiany. I wszystko ładnie, tylko co z tego?

Droga do kandydata na lek - 1 Wybór technik pozwalających w uproszczonym modelu sprawdzić na jaki parametr biologiczny substancja ma działać; 2. Przesiewowe testy na płytce sprawdzające jakie substancje z danej grupy wykazują jakieś działanie na badany preparat; 3. Testy in vitro konkretnych substancji, sprawdzające mechanizm i siłę działania; 4. Testy in vivo na modelu zwierzęcym; 5 Mamy kandydata do testów klinicznych. 90% badanych substancji nie dochodzi do ostatniego etapu.

  Z tego typu doniesieniami z badań in vitro jest ten problem, że trudno je wprost przełożyć na działanie na żywy organizm. Zwykle polegają one na tym, że traktuje się wyciągami próbkę komórek i sprawdza różnice w pewnych subtelnych parametrach. Tylko że nie można na takiej podstawie wyciągać zbyt szybkich wniosków. Jest to raczej wskazówka, że skoro w danym procesie w organizmie znaczenie ma pewien enzym, receptor czy szlak sygnałowy, a nasza substancja wpływa na ów enzym/receptor/szlak, to zadziała też na proces w organizmie, ale aby móc to z całą pewnością powiedzieć, należałoby przetestować to na tymże organizmie całym i żywym. Wynik testu in vitro jest więc wskazówką co do tego, co można dalej testować a co nie ma potrzeby, odsiewając preparaty nieczynne od najbardziej obiecujących.
  W ten sposób szybko sprawdza się setki substancji o potencjale czynności biologicznej i ich drobne chemiczne pochodne. Testuje się jeden po drugim różne modyfikacje znanych antybiotyków czy setki naturalnych alkaloidów, izolowanych z egzotycznych roślin. Jest to jednak dopiero początek drogi, przed nami jeszcze wiele innych testów, mających upewniać, że nie wypuszczamy na rynek bubla o wartości placebo. Jeśli dla jakiejś substancji mamy tylko i wyłącznie testy na preparatach komórkowych a nie kliniczne, wówczas nie jest to żaden dowód działania, tylko jak wspomniałem, wskazówka. W takiej sytuacji mówienie, że dana substancja już teraz, na pewno wykazuje działanie na człowieka, stanowi nadużycie. A w najlepszym razie nadmiar entuzjazmu.

  W dodatku warto pamiętać, że istnieje na prawdę bardzo dużo substancji, które stuprocentowo zabijają w próbówce komórki nawet najzłośliwszego nowotworu. Myślę, że domowy wybielacz wystarczałby w zupełności, ewentualnie stężony roztwór soli, kwas siarkowy czy podgrzanie całej próbówki do wrzenia. Informacja sprowadzona wyłącznie do "x niszczy w próbówce komórki raka", jest poznawczo bezwartościowa, bez wiedzy czy przypadkiem równie źle nie działa na komórki zdrowe. Czy przypadkiem nie jest po prostu tak szkodliwa, że zabiłaby pacjenta lepiej niż choroba

  Niestety wielu miłośników medycyny alternatywnej (oraz dziennikarzy popularnych gazet) uprawia takie właśnie zbyt szybkie wnioskowanie, połączone z pompowaniem efektownych haseł. Eksperymenty mają mieć znaczenie już teraz, bez wdawania się w niuanse i prawdopodobieństwa. Wyniki badań należy od razu zamienić w gotową praktyczną poradę dla czytelnika. Odbywa się to na zasadzie: "Jak stwierdzili amerykańscy naukowcy, wyciąg z korzenia berberysu zmniejszał proliferancję komórek nowotworowych prostaty o 10% bardziej niż u zdrowych... A zatem herbatka z bererysu leczy raka i to na pewno lepiej niż chemioterapia! Musicie ją pić!".


Bo komórki to nie organizm
  Głównym problemem w przenoszeniu badań na pojedynczych komórkach na działanie substancji na organizm, jest kwestia zmieniającej się ze skalą złożoności układu. Co innego komórki nowotworowe i może obok zdrowe w odpowiedniej zalewie, a co innego podanie równoważnej ilości do organizmu złożonego z dziesiątków typów komórek i tkanek prowadzących różne przemiany metaboliczne. To, że substancja na szalce nie wpływała istotnie na powiedzmy hepatocyty nie oznacza, że podobnie mało wrażliwe będą na nią neurony czy nefrocyty. Tymczasem często okazuje się, że to co ma leczyć chorobę w jednej części organizmu, wywołuje ją w innej. Jeśli zaś bilans zysków i strat pokaże, że korzyści zdrowotne nie są w stanie przeważyć skutków ubocznych, to taka substancja nie może stać się lekiem.

  Jeśli wyniki badań in vitro i na modelu zwierzęcym są obiecujące, przeprowadza się badania kliniczne I fazy, polegające na podawaniu różnych dawek zdrowym osobom i sprawdzaniu reakcji, zależności między dawką a stężeniem, szybkości eliminacji itp. I zwykle wychodzą na jaw efekty które wcześniej były trudno uchwytne, na przykład substancja wpływa na psychikę lub uczulająco albo po prostu na człowieka w całości działa inaczej niż się wydawało.
Właśnie na tym etapie wykłada się większość badanych substancji.

  To co sprawdzało się w wyidealizowanym modelu komórkowym, okazuje się nieprzydatne lub niebezpieczne dla żywego organizmu. Co z tego, że na szalce kwas dichlorooctowy zabijał komórki raka, skoro podany pacjentom powodował paraliż uszkadzając nerwy? [3] Co z tego, że abryna wydawała się selektywnym środkiem wywołującym apoptozę, skoro podczas testów klinicznych od zatrucia nią zmarł uczestnik?

  Podana substancja może też ulegać po drodze różnym przemianom metabolicznym i w ogóle nie docierać do miejsca, w którym ma działać. Woda utleniona reaguje z katalazami obecnymi w osoczu i tkankach i nie rozchodzi się po organizmie. Chondroityna czy kolagen w kapsułkach nie polepszają stanu stawów bo ulegają strawieniu. Lecytyna hydrolizuje w jelitach i nie dociera do mózgu gdzie rzekomo ma poprawiać pamięć. DMT i inne halucynogeny z tej grupy, zażyte samodzielnie nie wywołają żadnej ciekawej reakcji, z powodu rozkładania przez enzym monoaminooksygenazę.

Przykładowy test - żywe komórki zamieniają dodany wskaźnik w związek o barwie różowej. Stosując w kolejnych dołkach płytki coraz mniejsze stężenia badanych substancji, łatwo określić przy jakim najmniejszym stężeniu dana konkretna hamuje rozwój komórek. Stąd

Problem ilości
  Odmienne działanie na organizm niż na pojedyncze komórki, częściowo  jest pochodną bardziej ogólnego zjawiska - mianowicie warunki po podaniu substancji pacjentowi, są też pod tym względem inne niż test in vitro, że problematyczne jest osiągnięcie w organizmie stężenia takiego jak w testach.

  Zobaczmy na przykład jak wygląda doniesienie [4] reklamowane na alternatywnomedycznych portalach w formie "herbatka z mniszka zabija raka w 48 godzin". W badaniu porównywano wpływ wyciągu z korzeni na komórki czerniaka i komórki skóry zdrowe. Stwierdzono wystąpienie efektu (spadek wskaźnika żywotności komórki) o wielkości ponad 50% po czasie 48 godzin na komórkach rakowych linii A375 w stosunku do linii komórek zdrowych. Sukces? Być może, ale w badaniu na komórkach czerniaka z linii G361 (odporna na leczenie) wyciąg o tym samym stężeniu wykazywał działanie odwrotne - w porównaniu z komórkami zdrowymi przeżywały o 20-50% lepiej.
Dopiero użycie jeszcze większego stężenia pozwoliło na otrzymanie pozytywnych skutków.

Mogłoby to oznaczać, że na niektóre typy czerniaka (czerniak może być wywołany wieloma różnymi mutacjami) wyciąg wodny z mniszka działa kancerobójczo, a na inne w zbyt małym stężeniu wręcz ochronnie. I weź tu zgadnij jaki typ spośród setek możliwych mutacji ma osoba której poleca się herbatkę.

  Drugi problem to użyte stężenia. Efekt apoptyczny pojawiał się dla stężeń 2,5 mg/ml dla jednej linii komórek i 10 mg/ml dla drugiej linii, utrzymywanych w otoczeniu komórki przez 48 godzin. Stężenia dotyczą przy tym ilości użytego liofilizowanego ekstraktu wodnego, czyli ekstraktu, który odparowano otrzymując suchy proszek, z którego sporządzano potem roztwory.
  Stężenia 2,5 mg/ml i 10 mg/ml to 2,5g/l i 10 g/l. Takie stężenie powinny osiągnąć substancje z ekstraktu w płynie otaczającym komórki aby warunki były podobne jak w badaniu in vitro; w przypadku pacjenta będzie to krew. Ponieważ człowiek ma w organizmie około 5 litrów krwi, powinien wchłonąć od 12 do 50 g suchej substancji ekstraktu. Ale, ale - wyciąg wodny z mniszka zawiera małą ilość substancji rozpuszczonych. Aby wchłonąć takie ilości suchych substancji ekstraktu, pacjent musiałby wypić kilkanaście litrów naparu otrzymanego z powiedzmy kilku kilogramów mniszka. I utrzymywać takie stężenie przez 48 godzin... O ile oczywiście substancje aktywne (nie wiadomo nawet jakie) wchłoną się dostatecznie dobrze, bo mogą mieć niską, kilkuprocentową wchłanialność. O ile nie rozłożą się w organizmie pod wpływem enzymów. O ile nie okaże się, że w tak dużym stężeniu wywołują groźne skutki uboczne, których nigdy dotąd nie obserwowano, bo nikomu nie udało się uzyskać ich 1% stężenia we krwi.

  Jednak portale, powołujące się na te doniesienia, nie przejmują się szczegółami. Dla nich ważne jest tylko stwierdzenie, że herbatka ze znanego zioła "leczy raka w ciągu 48 godzin", mogą dzięki temu polecać czytelnikom aby sobie czasem popijali po szklance i mieli złudne przekonanie, że to ich przed czymś chroni. To tak jakby polecać na ból głowy 1/80 tabletki aspiryny.

  Jeśli jednak już uda się nam podać odpowiednio dużą dawkę związku, to może się okazać, że jest on w takiej ilości generalnie toksyczny. Przykładem mogą być ekstrakty z zielonej herbaty - wiele jest badań wskazujących na prozdrowotne właściwości zawartych w niej polifenoli, są także badania in vitro pokazujące wpływ hamujący na wzrost komórek rakowych. Jednak efekt stawał się wyraźny przy stosunkowo dużych stężeniach, będących odpowiednikiem wypijania dziennie 2-3 litrów naparu. Na szczęście z pomocą przyszli nam farmaceuci, oferujący suchy ekstrakt z zielonej herbaty w kapsułkach, pozwalający dostarczyć organizmowi trudne do uzyskania w normalny sposób dawki.
I niestety okazuje się, że w tych dużych ilościach ekstrakt z zielonej herbaty uszkadza wątrobę. Te same polifenole, które w mniejszych dawkach likwidują wolne rodniki, w większych zaburzają działanie mitochondriów, w których działaniu rodniki powstawać muszą.[5]


Przyprawione komórki fałszują wyniki
  Innym aspektem jest niedoskonałość samych metod badawczych. Prawdzie zmiany na wyizolowanych komórkach są łatwiejsze do opracowania, bo zbadać możemy od razu ich większą ilość i opisać wyniki ilościowo i statystycznie, ale w pewnych przypadkach charakter testowanej substancji może powodować błąd.
  Jednym z najczęściej stosowanych sposobów określenia żywotności komórek, jest podanie wskaźnika, który zostaje w żywych komórkach zmetabolizowany do formy, która świeci w ultrafiolecie. Im słabiej więc będzie świecić zawiesina komórek, tym gorsza jest ich żywotność. Wystarczy potraktować szereg próbówek badaną substancją, zmierzyć stosunek intensywności świecenia do stężenia i mamy wynik.

  Zastanówmy się jednak co takiego się stanie, gdy badana substancja przypadkiem dobrze pochłania ultrafiolet. Wciąż żyjące i dobrze się mające komórki, które ją wchłoną, będą świeciły słabiej, tak jakby brakło im trzy ćwierci do śmierci. Idźmy dalej - porównujemy wpływ tej substancji na komórki zdrowe i na chore, i te chore z pewnych powodów wchłaniają tej substancji więcej. Będą zatem świeciły wyraźnie słabiej od zdrowych, a nasze wyniki zostaną zafałszowane. Można temu przeciwdziałać uzupełniając badanie o drugą serię z innym wskaźnikiem, na przykład działającym odwrotnie (świecenie oznaką śmierci komórki). Bardzo duża różnica między wynikami z tych dwóch serii będzie wskazówką, że w eksperymencie tkwi błąd. Można też tak zaprojektować doświadczenie, aby ten efekt zminimalizować, na przykład stosując dalszą obróbkę zawiesin komórkowych, podczas której usuwamy badaną substancję a nie wpływamy na zmetabolizowaną formę wskaźnika, czy stosując taki zakres UV który nie jest pochłaniany.
  Wszystko to mogłoby bardzo pomóc uzyskać poprawne wyniki, ale wymagałoby dodatkowych nakładów, oraz mogłoby sprawić, że bardzo obiecujące wyniki nie będą już tak zachwycające.

  Przykładem takiej sytuacji, są omawiane w zeszłorocznej analizie z Nature badania aktywności biologicznej kurkumy [6]. Jest to żółtopomarańczowy pigment, dobrze rozpuszczalny w tłuszczach, będący składnikiem przyprawy kurkumy oraz mieszanki curry. Od lat bardzo intensywnie bada się kurkuminę, która okazała się posiadać bardzo obiecujące właściwości przeciwnowotworowe, przeciwzapalne, neuroprotekcyjne czy przeciwwirusowe. Spora część z tych właściwości została stwierdzona w badaniach in vitro. Problem w tym, że lipofilna kurkuma osadza się w błonach komórek i zasłania ich wnętrze, oraz jest przypadkiem... substancją pochłaniającą ultrafiolet.

  W przeglądzie badań kurkuminy autorzy stwierdzili, że duża część eksperymentów w ogóle nie brała tego czynnika przeszkadzającego pod uwagę; wykonano je tak, jakby barwna substancja o charakterze pigmentu była przezroczysta. Drugim problemem badań nad tą substancją, było użycie zanieczyszczonych preparatów. Jeśli jako "kurkuminę" użyto wyciągu z kłącza ostryżu, to w rzeczywistości badana substancja była mieszaniną dziesiątków związków. Kurkumina mogła fałszować wyniki także za sprawą własności chelatowania metali (np. nie odwracała skutków toksyczności metali ciężkich na komórki, tylko zmniejszała ich ilość w roztworze), aktywności redoks (utlenianie lub redukowanie wskaźników poza komórką), tworzenie agregatów a w pewnych warunkach rozkład na zupełnie inne substancje.
  Wiadomo na przykład, że w warunkach lekko zasadowych, podobnych do odczynu krwi, kurkumina staje się niestabilna, co przyspiesza w temperaturach wyższych niż pokojowa; obserwowane efekty mogą więc wynikać z działania produktów rozkładu (a skoro tak, lepiej jako leki testować je właśnie) o trudnym do określenia stężeniu w czasie doświadczenia.
  W stężeniach zbliżonych do używanych w doświadczeniach, wykazuje skłonność do tworzenia agregatów z białkami i lipidami, które mogą naśladować selektywną inhibicję. Związek po prostu oblepiał komórkę, zamiast wybiórczo wiązać się z wybranymi białkami, biorącymi udział w procesie chorobowym. Gdy w testach badających siłę wiązania z enzymami, do kurkumy dodano nieaktywny biologicznie detergent zapobiegający tworzeniu agregatów, zmierzona aktywność związku spadała wyraźnie. Bez niego cząsteczki enzymu w roztworze zlepiały się przy udziale kurkuminy w białkowe kłębki.

  W cytowanym badaniu przeciwdziałania formowania się włókien białek Tau, które odpowiadają za rozwój choroby Alzheimera, pierwszy test wydawał się bardzo obiecujący. Eksperyment oparty o badanie intensywności fluorescencji tioflawiny, gromadzącej się w złogach białkowych, wydawał się pokazywać, że kurkumina hamuje powstawanie włókien w bardzo małych stężeniach. Eksperyment używający techniki fluorescencji polaryzacyjnej pokazał jednak wynik odwrotny, kurkumina działała bardzo słabo. Później okazało się, że kurkumina pochłaniała światło w zakresie w którym świeciła tioflawina, czyli zasłaniała ją fizycznie, udając aktywność biologiczną.

  Konkluzją autorów było stwierdzenie, że duża część badań mających wykazywać wysoką siłę leczniczą kurkuminy, została przeprowadzona w warunkach w których większą rolę zaczynają odgrywać czysto fizyczne właściwości związku, które fałszowały wyniki. Natomiast w badaniach dobrze przeprowadzonych, w których unikano tych niepożądanych efektów ubocznych, kurkumina okazywała się działać dość słabo. Nie skreśla to całkiem tego związku, są bowiem badania wskazujące, że w pewnych przypadkach ma on faktycznie pewne zastosowanie, pokazuje jednak, że ostatnia moda na polecanie tej przyprawy w charakterze panaceum na wszystko, ma w rzeczywistości bardzo kruche podstawy.

   Zbliżone efekty zakłócające może wywoływać reserwatrol, polifenol występujący między innymi w czerwonym winie, o bardzo obiecujących właściwościach biologicznych. Jedną z technik badania intensywności metabolizmu w komórkach, jest oznaczanie ilości wytwarzanego ATP. Do preparatu z rozbitych na kawałki komórek dodaje się lucyferynę i enzym lucyferazę. Substratem reakcji jest ATP z cytoplazmy.
  Jak wykazały badania, reserwatrol jest inhibitorem lucyferazy. Może więc sprawiać wrażenie, że zmniejszył ilość ATP w traktowanych nim komórkach, gdy tak na prawdę jedynie zahamował reakcję odczynnika.[7]

Samo in vitro nie wystarczy
  Jak to już wspominałem, jeśli ktoś reklamujący gotowy preparat oferuje go chorym jako działający lek, a na poparcie ma tylko i wyłącznie wyniki testów in vitro, to oszukuje potrzebujących. Albo jest świadomym oszustem albo nie rozumie badań na które się powołuje.
 Na takich właśnie dowodach opiera się duża część reklam cudownych leków, witamin czy używek, w ostatnim czasie widziałem dużo artykułów o medycznej marihuanie, w których dowodami były tylko takie badania. Weźmy choćby taki popularny w internecie artykuł [8] twierdzący, że przeciwnowotworowe działanie marihuany potwierdza aż 100 badań naukowych. Wśród zaprezentowanych linków znalazło się kilkanaście prac przeglądowych (czyli podsumowania innych, w tym cytowanych w artykule, prac, nie będące kolejnym badaniem), kilka prac w których nie badano wpływu zdrowotnego tylko farmakokinetykę (szybkość wydalania i metabolizmu) oraz prawie 80 prac w których badano wpływ różnych kannaboidów na linie komórkowe w próbówkach (tak, przejrzałem wszystkie linki).
   W sekcji na temat chłoniaka nie zacytowano żadnego badania dotyczącego marihuany, wszystkie cztery dotyczyły wpływu syntetycznego związku anandamidu, który jest agonistą receptorów kannaboidowych; znalazły się w tym zestawieniu  tylko z powodu nazwy receptora. W sekcji "nowotwory szyi i głowy" zacytowano badanie, które... w ogóle nie dotyczyło leczenia nowotworów; stwierdza się w nim jedynie, że z ankiet u pacjentów z nowymi diagnozami wynika większe ryzyko nowotworów u palących tytoń i pijących alkohol i brak zmiany ryzyka u palących trawkę. Między stwierdzeniem "x nie wpływa na nowotwory" a twierdzeniem "to badanie potwierdza, że x leczy nowotwory" jest potężna różnica.

I właśnie dlatego marni dziennikarze, sprzedawcy tabletek i paramedycy, tak gorąco kochają in vitro.
--------
* Natomiast  eksperymentach na żywych organizmach to "in vivo". Dla porządku wymyślono też określenie dla "eksperymentów" symulacyjnych na komputerach, czyli "in silica" jako że jak na razie mikroprocesory są oparte o półprzewodnikowy krzem. Zastanawia mnie jak w tej sytuacji określić eksperymenty myślowe - In mentis?

[1] Metody badania aktywności leków in vitro
[2] Techniki stosowane w badaniach toksyczności in vitro.

[3] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16476929
[4]  https://www.hindawi.com/journals/ecam/2011/129045/

[5] http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1742-7843.2004.pto_950407.x/full
[6]  http://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.6b00975

[7]  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17064666/

[8] https://motywatordietetyczny.pl/2016/05/ponad-100-badan-naukowych-potwierdza-marihuana-niszczy-raka/