Elektroforeza to technika analityczna w dużej mierze zbliżona do chromatografii, w niektórych podręcznikach klasyfikowana jako jeden z jej działów. Zasadniczo główną zasadą rozdziału mieszanin jest tu skorzystanie ze zjawiska ruchu jonów w polu elektrycznym. Każda cząstka naładowana znalazłszy się w polu elektryczny zaczyna być przyciągana w kierunku elektrody o przeciwnym znaku. Aniony zbliżają się do dodatnio naładowanej anody a kationy do ujemnie naładowanej katody. Już to może stać się podstawą rozdziału prostych substancji, bardzo ładny przykład widać w tym filmiku, gdzie żółty anion chromianowy oddziela się od niebieskiego katjonu kompleksowego tetraaminamiedzi. Zasadnicza różnica między migracją jonów a elektroforezą jest ta, że w tym drugim przypadku wędrują duże cząsteczki naładowane, na przykład stałe cząstki koloidu, wielkomasowe białka albo takie cząsteczki jak kwas deoksyrybonukleinowy.
Sam ruch cząstek nie miał by wielkiego znaczenia dla analityki, gdyby nie fakt, że różne cząsteczki poruszają się z różną prędkością. W zasadzie szybkość ruchu jest tym większa, im większy niesie ładunek, i tym mniejsza im większa jest to cząsteczka. Pewne znaczenie ma też kształt oraz inne oddziaływania z ośrodkiem, którym może być roztwór lub specjalny żel, rzadziej bibuła.
Jak to ma się jednak do badania DNA? Przecież w każdej komórce jest jedna, taka sama cząsteczka, co tu więc do rozdzielania? Dobre pytanie. Biolodzy też długo nie mogli wpaść na to jak to zrobić, aż wreszcie ktoś odkrył enzymy restrykcyjne i wszystko stało się jasne.
Restryktazy to specyficzne enzymy wytwarzane przez bakterie i sinice, zapewne jako mechanizm obronny przed wirusami. Rozcinają one łańcuch DNA na obu niciach w miejscu w którym pojawia się specyficzna sekwencja zasad nukleinowych. Na przykład enzym EcoR I rozcina DNA w miejscu komplementarnych sekwencji GAATTC i CTTAAG, enzym Taq I w miejscu TCGA i AGCT, zaś Not I w miejscu GCGGCCGC i CGCCGGCG. Jak łatwo się domyśleć, ponieważ różne osoby mają różne geny, po rozcięciu ich DNA postanie nam mieszanina fragmentów i różnej długości i wielkości frakcji.
Powiedzmy że mamy łańcuch o zasadach: CCCAGAGGCCTTCTGGAGGAGTTGTTATCCTCGAAGACCACCGTTGACAGATT
i trzy enzymy, jeden rozcina łańcuch w miejscu AGA, drugi w GTTG a trzeci w TCCT.
Po zmieszaniu roztworu łańcucha z pierwszy otrzymamy mieszaninę fragmentów:
-ATT
-CCCAG
--ACCACCGTTGACAG
-AGGCCTTCTGGAGGAGTTATTGTCCTCGAAG
Z drugim:
-CCCAGAGGCCTTCTGGAGGAGT
-TGTTATCCTCGAAGACCACCGT
-TGACAGATT
Z trzecim:
-CCCAGAGGCCTTCTGGAGGAGTTGTTATC
-CTCGAAGACCACCGTTGACAGATT
Im dłuższy fragment tym wolniej będzie się poruszał a więc tym bliżej znajdzie się miejsca naniesienia. Jeśli więc weźmiemy naszą próbkę łańcucha, potraktujemy osobno trzema enzymami i naniesiemy na płytkę, to otrzymamy w przybliżeniu coś takiego:
Jeden enzym dał dwa długie fragmenty, drugi dwa długie i jeden krótki a trzeci cztery różnej długości. Jeśli dysponujemy długim łańcuchem i porozdzielamy go kilkoma lub kilkunastoma enzymami, otrzymamy na płytce wzór składający się z prążków o różnym przesunięciu i natężeniu, a liczba wszystkich możliwych kombinacji jest olbrzymia. W badaniach DNA zakłada się, że dla różnych ludzi wzór utrwalony na płytce będzie różny, stąd możliwość identyfikcji tożsamości lub pokrewieństwa.
W naszym pokazowym doświadczeniu procedurę mieliśmy już o tyle uproszczoną, że próbką badaną był wzorcowy roztwór pociętego DNA plazmidowego, pozostawało nam zatem przygotować płytkę i nanieść próbkę. Ten typ badania standardowo wykonuje się w żelu agarozowym. Agaroza to właściwy środek żelujący wyodrębniany z agaru naturalnego. Przygotowanie jest dosyć proste. Odważoną ilość agaru należało rozpuścić w gorącym roztworze zasadowego buforu, dodać odczynnika barwiącego kwasy nukleinowe i przelać do odpowiedniej kuwety, wkładając przed zatężeniem plastikowy "grzebień". Po zastygnięciu w miejscu grzebienia pozostają równe zagłębienia, stanowiące kuwetki na próbki:
Po oznaczeniu spektrofotometrycznie stężenia wzorca i po zmieszaniu go z roztworem barwnika należało pobrać go mikropitetą i wkroplić do zagłębień. Cała płytka była już wtedy zalana roztworem elektrolitu, dlatego nieco cięższy roztwór próbki należało bardzo ostrożnie umieścić w zagłębieniach, tak aby nie wypłynął - co nie było wcale takie łatwe. A potem należało włączyć prąd i poczekać. Jako że mamy tu do czynienia z kwasem organicznym, należy oczekiwać że w środowisku zasadowym na resztach fosforanowym pojawią się ładunki ujemne, a zatem cała cząsteczka będzie wędrowała ku dodatnio naładowanej anodzie.
DNA jest bezbarwne, jak więc ujawnić prążki frakcji? Zajął się tym dodany do żelu odczynnik, którym był w tym przypadku bromek etydyny, związek organiczny mającego skłonność do tworzenia trwałych kompleksów z DNA, wpasowując się pomiędzy nicie. W związku z tym przy pracy z nim należało zachować ostrożność, łatwo bowiem wchłania się przez skórę a z racji właściwości jest silnym mutagenem. Bromek ma też tą właściwość, że wyraźnie świeci w świetle ultrafioletowym. Dlatego po odczekaniu odpowiedniego czasu wyjęliśmy żel z płytki i w zaciemnionym pomieszczeniu podświetliliśmy ultrafioletem, ujawniając nieco może niewyraźne ale widoczne prążki frakcji.
Nie próbujcie tego w domu...
Brak komentarzy:
Prześlij komentarz