Kiedyś w laboratorium (81.) - kolorymetryczne oznaczanie glutenu

 Gdy jeszcze pracowałem w laboratorium kontroli jakości w Korycinach, jednym z ważnych ale bardzo rzadko wykonywanych oznaczeń, było sprawdzanie obecności i stężenia glutenu w produktach, co do których producent chciał się chwalić, że są nisko/bezglutenowe.

Samo tylko branie surowców roślinnych, które glutenu w sobie nie zawierają, to jeszcze za mało, aby produkt można było w taki sposób oznaczać. Wystarczą zanieczyszczenia na linii produkcyjnej i kłopot gotowy. Słyszałem, że zdarzały się przypadki silnego zanieczyszczenia ziół pszenicą z powodu użycia do zbioru z pola kombajnu, wcześniej użytego do zbóż; dlatego zapewnienia dostawcy, że roślina nie rosła obok pszenicy trzeba brać ostrożnie. Podobny problem dotyczy przypraw - te sprowadzane z zagranicy już sproszkowane mogą być zanieczyszczone, choćby z powodu praktyki przesypywania niezmielonych części jakąś mączką aby się nie sklejały na pryzmie.

Wedle przepisów, za bezglutenowy podać można produkt zawierający mniej niż 20 ppm glutenu; to jest mniej niż 20 mg/kg. Granica jest więc mocno wyśrubowana i nietrudno o jej przekroczenie. Więc aby nie było problemów, skarg od klientów czy wycofywania partii, dobrze jest badać sprawę na miejscu.

W laboratorium używaliśmy testu immunochemicznego Elisa, z użyciem gotowych płytek z dołkami, odczytywanych przez specjalny skaner. Zawartość glutenu wpływała na natężenie koloru w dołku, było to zatem oznaczanie kolorymetryczne.

Płytka testowa. W górnym rzędzie próby ślepe i seria wzorców

Metodyka działania testów Elisa jest w większości przypadków podobna i opiera się o podobne mechanizmy co odporność organizmu i reakcja na patogeny. Organizm po wprowadzeniu do niego obcego białka, czyli antygenu, wytwarza rozpoznające je przeciwciała. Te po związaniu się z antygenem tworzą kompleks, który jest zjadany i unieszkodliwiany przez białe krwinki. Specyficzność wiązania przeciwciała z antygenem jest wysoka, stąd pomysł użycia do testów chemicznych.

Test używany w tym przypadku opierał się o technikę podwójnego wiązania. Dołki w płytce do testów zawierają żelowe podłoże, w którym związane zostały specyficzne przeciwciała anty-gluten. Po wprowadzeniu do dołu roztworu otrzymanego z próbki, obecny gluten wiąże się z przeciwciałami, tworząc jednostronny kompleks:

Płytka--[przeciwciało]----(gluten)

Roztwór jest teraz wylewany a dołek przepłukiwany buforem. Chodzi o usunięcie śladów niezwiązanego antygenu, aby nie przeszkadzał. Teraz dołek zawiera podłoże z unieruchomionym kompleksem, w którym gluten jest przyłączony na raz tylko z jednym przeciwciałem od jednej strony. Teraz dodajemy do dołka drugi roztwór, zawierający kolejne przeciwciała anty-gluten, ale tym razem połączone ze znacznikiem. Dla większej specyficzności powinny to być przeciwciała wiążące się z drugim końcem antygenu, niż te związane z podłożem. Obrazowo można by to wyjaśnić, że pierwsze wiążą się z sekwencją "glu" a drugie z sekwencją "ten".

Drugie przeciwciała zawierają połączony z nimi jakiś enzym, który posłuży do uwidocznienia. Może to być peroksydaza chrzanowa, która utlenia pewne związki pod wpływem wody utlenionej, albo jakaś fosfataza. Powstaje teraz kompleks dwustronny, z przeciwciałem obklejonym antygenami z dwóch stron:

Płytka---[przeciwciało]----(gluten)----[przeciwciało]---enzym

Cały ten długi łańcuch służy więc w istocie temu, aby przytwierdzić do podłoża enzym końcowy. Po kolejnym przepłukaniu dołka zalewa się go w końcu właściwym substratem. Jest to jakiś związek, który w warunkach roztworu jest przemieniany enzymem w inną substancję o wyraźnym zabarwieniu. Substrat ma w roztworze pewne określone stężenie. Enzym ma w buforze aktywność, to jest "moc przerobową" wywołania reakcji określonej ilości cząsteczek w jednostce czasu, dlatego reakcja powinna trwać przez konkretny czas, przewidziany przez producenta. Reakcję przerywa się następnie roztworem kończącym i w tym momencie intensywność zabarwienia, czyli po prostu stężenie produktu barwnego, zależy od stężenia antygenu w próbce. W moim przypadku substratem była zapewne tatrametylobenzydyna, która utleniona peroksydazą zamienia się w niebieski barwnik. 

 

Roztwór kończący to kwas siarkowy, który uniemożliwia dalsze utlenianie substratu i zmienia jego kolor na żółty. Podobna reakcja utlenienia benzydyny, katalizowana przez hemoglobinę, bywa czasem używana do kryminalistycznego wykrywania śladów krwi.

Jak łatwo się domyśleć, jeśli w roztworze nie ma antygenu, to całe te łańcuchy kompleksów się nie tworzą,  dodane na sam koniec przeciwciała z enzymem nie zostają związane i wypłukuje je płukanie dołka. Z kolei w razie obecności antygenu ilość cząsteczek enzymu związanego na samym końcu zależy od ilości cząsteczek antygenu w początkowym roztworze, co przy standaryzowanym stężeniu substratu i określonym czasie trwania reakcji doprowadza do stężenia końcowego produktu barwnego zależnego dokładnie od stężenia antygenu w próbce. Czyli w tym przypadku od ilości glutenu. Czułość testu była dostatecznie duża, aby wykryć śladowe ilości glutenu w próbkach zawierających go nawet kilka razy mniej niż ustawowe 20 ppm.

Sama procedura analityczna nie jest skomplikowana, ale może być nieco uciążliwa i czasochłonna. Próbki zmielić oddzielnie lub przy pomocy młynka przepłukiwanego dokładnie po każdej innej próbce. Roztwory na dołki nakłada się pipetą automatyczną na określony czas, co może sprawiać problemy przy dużej ilości próbek. Pamiętam jak raz użyliśmy całej jednej płytki (45 próbek po 2 razy). Nie mieliśmy na stanie pipety z rzędem wielu końcówek, więc aby wyrobić się z dodawaniem odczynników do wszystkich dołków w przepisowym czasie, pipetowaliśmy na cztery ręce, bo inaczej zanim by się z jedną pipetą doszło do 96 dołka, to z pierwszego już trzeba wylewać. Cała procedura to "wlej do dołka roztwór 1 i poczekaj X minut, wylej, dodaj roztwór 2 i odczekaj x minut; wylej, dodaj bufor, wylej, powtórz płukanie, wylej, dodaj roztwór 4 itd. itp.".

Odczynniki mają ograniczoną trwałość i muszą być przechowywane w zamrażarce, i w zasadzie to one są najdroższe w całym tym oznaczaniu.