Barwienie bakterii metodą Grama

Dawno, dawno temu, kiedy jeszcze uczyłem się w technikum chemicznym, jednym z przedmiotów była bioanaliza, gdzie uczyliśmy się jak badać mocz, rozpoznawać pod mikroskopem różne limfocyty, albo badać zawartość cholesterolu w osoczu.
Jednym z ciekawszych ćwiczeń była hodowla bakterii z powietrza - sterylną płytkę z podłożem odkrywało się na określony czas w nieruchowym powietrzu pomieszczenia, zakrywało i wstawiało do inkubatora. Bakterie które znajdowały się w powietrzu osiadały na płytce i tworzyły kolonie - jedna bakteria tworzyła jedną kolonię. Zliczając ilość kolonii na powierzchni płytki i znając czas wystawienia płytki, można było policzyć stężenie bakterii w powietrzu - całkiem proste.

Jednak otrzymane bakterie dobrze jest też jakoś zidentyfikować. Oprócz opisanych już kiedyś metod hodowli na podłożu różnicującym, inną techniką jest barwienie metodą Grama. Badanie obejmuje kilka etapów, a wszystkie je sfotografowałem.

Zasadnicza różnica między typami bakterii jaką wykrywa się w tym badaniu, to grubość i przenikliwość ściany komórkowej - w jednym bakteriach jest cienka, w innych stosunkowo gruba. Ma to wpływ na ogólną fizjologię bakterii, zaś dla medycyny znaczenie ma różna wrażliwość na leki - zasadniczo bakterie o grubszej ścianie komórkowej są bardziej odporne, z powodu słabszego wchłaniania antybiotyku do wnętrza. Różna grubość ścian komórkowych wykrywana jest przez selektywne wybarwianie fioletem krystalicznym. W jaki sposób?

Na początek należy sobie wybrać jakąś kolonię z której będziemy robić rozmaz:

Ja akurat wybrałem sobie taką w której na kolonię żółtą naciekała biała, mając nadzieję że uda mi się złapać dwa różne typy. Masę kolonii pobierałem ezą, to jest pętelką z drutu z rączką. Tę jednak należało przedtem wyżarzyć, aby usunąć wszystkie inne bakterie:

Ponieważ kolonia miała postać stałej masy, najpierw nabrałem nieco soli fizjologicznej:

potem nieco kolonii:

i rozmazałem na płytce:

Rozmaz należało teraz wysuszyć i utrwalić, aby bakterie dobrze przylegały do podłoża. Dlatego po podsuszeniu w suszarce przeciągnęliśmy płytki nad płomykiem lampki spirytusowej, tak aby masa bakteryjna "przyschła" do płytki.

Wszystkie płytki należało teraz umieścić nad tacką, założyć rękawiczki i uważać na ubranie, bo można się było nieźle pobrudzić. Najpierw każda płytka została zalana roztworem fioletu krystalicznego:

Następnie czekaliśmy dwie minuty, po czym zlaliśmy barwnik do tacki:

Nie usuwając całej cieczy, zalewaliśmy płytki płynem Lugola - na powierzchni płynu powstawała błyszcząca warstewka, jak podejrzewam był to wydzielający się jod. Płyn dzięki temu błyszczał i opalizował, wyglądając jak odwłok złotego żuka:

Po około trzydziestu sekundach zlaliśmy ciecz i dokładnie przemyliśmy alkoholem:

A następnie wodą:

Na sam koniec zalaliśmy płytki roztworem fuksyny:

Pół minuty potem zlaliśmy ją do tacki, płytki przemyliśmy wodą i osuszyliśmy w suszarce. Tak zabarwione płytki nadawały się do badania mikroskopowego:

Co takiego następowało podczas wybarwiania? Gdy zalewaliśmy płytki roztworem fioletu krystalicznego, wnikał on do bakterii zabarwiając je wszystkie. Dodany potem roztwór jodu dodatkowo przyciemniał zabarwienie poprzez tworzenie kompleksów jodu z barwnikiem. Na tym etapie zabarwione były wszystkie.
Jednak gdy przemywaliśmy płytki alkoholem, zaznaczyła się różnica - łatwo wypłukiwał on barwnik z bakterii o cienkiej ściance, natomiast nie był w stanie odbarwić bakterii o ścianie grubej. W efekcie te pierwsze stawały się bezbarwne, zaś te drugie ciemnofioletowe. Gdy zalaliśmy płytki fuksyną, odbarwione bakterie o cienkiej ścianie zabarwiły się na różowo. Te o grubej także, ale mocniejszy kolor fioletu zagłuszał róż.
W efekcie bakterie o ściance cienkiej zabarwiły się na różowo a te o grubej na ciemno fioletowo. Rożróżnianie bakterii pod mikroskopem jest zatem bardzo łatwe - bakterie Gram+ są fioletowe a Gram- różowe.

Akurat mnie, jako chemika-estetę bardziej zainteresowały kryształy fuksyny, które wykrystalizowały na płytce. Tutaj pęk kryształów w otoczeniu bakterii gram-ujemnych (powiększenie ok. 400X):

A tutaj w otoczeniu gram-dodatnich (pow. ok. 600X):

I na koniec mieszanka dwóch różnych typów bakterii:

Dzisiaj na egzaminie...

... zostałem umagistrzony. I dobrze mi z tym.

Dojechałem do Siedlec nad ranem, aby jeszcze na ostatnią chwilę przejrzeć pytania. Najbardziej obawiałem się pytań o grupy zabezpieczające, bo nie wszystkie pamiętałem, dlatego jeszcze sobie powtarzałem. Pewną obawę wywoływało też pytanie o reakcje sprzęgania, wprawdzie bowiem umiej je objaśnić i podać przykłady, ale mylą mi się ci wszyscy Japończycy, który jest od której.

Z natury jestem osobnikiem łagodnego usposobienia, dlatego denerwować zacząłem się dopiero teraz. Nie byłem pewien jak jest z możliwością poprawki. Pozostało mi czekać tylko na członkow komisji. Równo o 11 wezwano mnie do gabinetu, gdzie siedziała już cała trójka - promotor, recenzent i przewodniczący.

Na początek proszę krótko przedstawić założenia i wyniki pracy.
A więc... (czy zaczyna się zdanie od "a więc"? - przemknęło mi przez myśl). Celem mojej pracy była synteza chiralnych ligandów...
Objaśniłem jakie prace na ten temat były już przeprowadzane, i wobec tego w którym kierunku prowadziłem swoje. Opisałem dwa etapy syntezy. Potem pierwsze sprawdzanie aktywności. Potem wpływ rozpuszczalników i zmiany soli. Na koniec pokazałem tabelkę z wynikami testowania ligandów w reakcji z różnymi aldehydami.
Pytanie - a proszę wobec tego wyjaśnić, dlaczego tu z benzaldehydem reakcja nie zachodzi.
Bo pewnie jest to związek mało reaktywny - strzeliłem z głupia frant.
A co wpływa na reaktywność aldehydów w takiej reakcji? Jakby pan to narysował dla różnych podstawników...
Więc narysowałem tą addycję i cząstkowe ładunki grupy karbonylowej po czym objaśniłem jak na reakcję wpływają podstawniki "wyciągające" i "napychające" ładunek pierścienia. Wszystko zgodnie z wiedzą. Tyle że z tego wynikało, że aldehydy z podstawnikami alkilowymi powinny być jeszcze mniej reaktywne niż benzaldehyd, a było odwrotnie. I oczywiście recenzent o to zapytał.
Chm... No to widocznie jest mało reaktywny w tej konkretnej reakcji? Recenzent  pokręcił głową.
Zasadę reaktywności pan zna, ale w tym konkretnym przypadku obstawiam na co innego - benzaldehyd łatwo się zakwasza i neutralizuje zasadę potrzebną do przebiegu reakcji. A teraz proszę wylosować pytania.

Jakoś tak mi się trafiło, że wylosowałem chyba najłatwiejsze - wyjaśnić pojęcia w temacie stereochemii i podać przykłady reakcji alkenów z czynnikami nukleofilowymi, rodnikowymi i utleniającymi. Ucieszyło mnie to bo wcześniej to powtarzałem, przez co do każdego zagadnienia podałem po dwa przykłady. Potrzebne były jeszcze dopytania, bo gdy jako przykład reakcji utleniającej podałem ozonolizę, to zapytano mnie o nazwę cyklicznego związku przejściowego, czego nie pamiętałem.
Na koniec pytanie odnośnie mechanizmu i stereochemii reakcji Henry'ego. To było w zasadzie proste, nie byłem tylko pewien czy proton dodawany na samym końcu reakcji pochodzi ze zprotonowanej zasady czy z będącego medium izopropanolu. No dobrze. Może pan poczekać na zewnątrz.

Toteż z drżącymi kolanami ale już uśmiechem na ustach, wyszedłem. A jaki był wynik? Nie najgorszy. Praca została oceniona zasadniczo dobrze, choć parę pomyłek w bibliografii się ostało (większość nazw czasopism w skrócie, kilka w formie pełnej). To, plus ocena z egzaminu dało mi łącznie ocenę 4,5.

Na koniec profesor zapytał a gdzie się wybieram po tym? Z rozbrajającą mnie samego szczerością wyznałem że nie mam pojęcia, ale myślę o studiach doktoranckich. Gdzieśtam...
To jeśli tak, to we wrześniu będzie nabór w PAN-ie - podsunął. Pomyślę. W zasadzie to ostatnio zainteresowała mnie chemia supramolekularna...
A to by nawet pasowało, bo się tam tym zajmują - objaśnił profesor, i szczerze mówiąc bardzo mnie tym zainteresował....

To jest już koniec

I wszystko jest.

Dziś właśnie wydrukowałem pracę magisterską, jutro ją będę składał w dziekanacie. UFF!

Synteza trójcyklicznej oksazoliny

Oksazoliny to pierścieniowe, pięciokątne związki organiczne, zawierające atomy tlenu i azotu w pozycji 1,3. Możliwe są trzy izomery różniące się położeniem wiązania podwójnego, ja jednak będę się zajmował dziś tylko 2-oksazoliną. (pierwsza od lewej)

Ich użycie jako ligandów w syntezach asymetrycznych wiąże się z dwiema cennymi właściwościami - chętnie kompleksują metale, oraz łatwo jest otrzymać związki z podstawnikami przy centrum stereogenicznym o określonej konfiguracji. Dzięki temu możliwe jest tworzenie ligandów kierujących reakcję do określonego izomeru.

Istnieje kilka różnych metod syntetycznych oksazolin, wszystkie jednak opierają się na wykorzystaniu aminoalkoholi, te zaś otrzymuje się z redukcji naturalnych aminokwasów. W moim przypadku była to synteza Witte'a-Selingera[1] z użyciem nitryli:

Podaje się taki oto mechanizm utworzenia pierścienia[2]:

 Kwas Lewisa aktywizuje nitryl przez przyłączenie do azotu, tworząc kation nitryliowy. Do niego do węgla z ładunkiem dodatnim dołącza się azot aminoalkoholu. W kolejnym etapie pęka wiązanie podwójne w części iminowej, węgiel przyłącza się do tlenu a azot odchodzi. Powstaje pięciokątny pierścień z niezmienioną konfiguracją centr stereogenicznych.

Oksazolina którą miałem otrzymywać miała postać trzech pierścieni skondensowanych, ponieważ przyłączona część przypomina indol, będą ją dalej nazywał indeno-oksazoliną:

Substratem do reakcji był 2-aminobenzonitryl, drugim zaś (1R,2S)-1-amino-2-indanol, ale na początku należało przygotować katalizator - bezwodny chlorek cynku.

Chlorek cynku ma postać białego, drobnego proszku, niestety łatwo łapiącego wilgoć z powietrza. Aby więc uzyskać bezwodny, musiałem go mocno podgrzać - wsypałem go do tygla a ten umieściłem nad palnikiem. Chlorek stopił się w rzadką, ciemną ciecz:

Teraz należało go ochłodzić ale tak, aby nie zestalił się w jedną masę i aby zarazem nie nabrał znów wilgoci. W tym celu tygiel umieściłem w strumieniu argonu pod dużym lejkiem, i intensywnie mieszałem aby rozetrzeć tężejącą masę:

Gdy chlorek był już przygotowany, odważyłem szybko potrzebne ilości reagentów i umieściłem w kolbie. Dodałem chlorobenzenu, wrzuciłem mieszadełko i nasadziwszy chłodnicę zwrotną nastawiłem na mieszanie przez dwa dni:

Reakcja była prowadzona w atmosferze argonu, aparatura wcześniej dobrze wysuszona.

Po przepisowym czasie, mieszaninę reakcyjną odparowałem pod obniżonym ciśnieniem aby usunąć rozpuszczalnik, po czym dobrze zdrapałem z dna łopatką i zalałem 30% roztworem wodorotlenku sodu.  Oksazoliny, jak już tłumaczyłem, chętnie tworzą kompleksy z metalami, tak też działo się z produktem - tworzył dobrze związany kompleks z cynkiem i aby go wyodrębnić, należało ten kompleks czymś rozbić. Reakcja z ługiem służyła właśnie temu.

Gdy dobrze roztarta mieszanina przereagowała, ekstrahowałem z niej właściwy produkt chlorkiem metylenu, trzy razy zlewając warstwę organiczną, którą po wysuszeniu siarczanem magnezu odparowałem. Teraz pozostał mi już tylko rozdział na kolumnie chromatograficznej. Za eluent posłużyła mieszanka heksan/chlorek metylenu 8:1:

Na płytce oświetlonej UV indeno-oksazolina dawała nie zbyt intensywną niebieską fluoryzację (najmocniejsza plamka w środku).
Gdy zebrałem już czystą frakcję, odparowywałem ją, zauważając przy tym szczególną postać - związek krystalizował jako długie, białe igły, na tyle cienkie i giętkie, że podczas odparowywania w obrotowej wyparce splotły się w skręcone włókna, wypełniając kolbkę masą podobną do waty:

Wydajność reakcji była dobra, wynosząc 92%
--------
[1] Konrad Weickhardt, Margareta Zehnder, Tobias Ranf, Carsten Bolm, Synthesis of Optically Active  Bis(2-oxazolines): Crystal Structure of a 1,2-Bis(2-oxazolinyl)benzene ZnCl2 Complex, Chemische Berichte, Volume 124, Issue 5, pages 1173–1180, Mai 1991

[2] Moghadam M. et al. , InCl3 as an Efficient Catalyst for Synthesis of Oxazolines under Thermal, Ultrasonic and Microwave Irradiations, J. Iran. Chem. Soc., Vol. 6, No.2, June 2009, pp. 251-258