informacje



Pokazywanie postów oznaczonych etykietą DNA. Pokaż wszystkie posty
Pokazywanie postów oznaczonych etykietą DNA. Pokaż wszystkie posty

niedziela, 9 lipca 2017

Chemiczne wieści (11.)

Dwie wody
Woda to jedna z najprostszych substancji na naszej planecie, złożona z jednych z najlżejszych pierwiastków - i paradoksalnie właśnie dlatego skomplikowana. Duża elektroujemność tlenu w połączeniu z faktem że wodór ma najmniejszy atom z wszystkich pierwiastków powodują, że po spolaryzowaniu wiązania atomy wodoru stają się bardzo skoncentrowanymi punktami dodatniego ładunku. Między nimi a pełnymi elektronów bardzo elektroujemnymi niemetalami mogą powstawać słabe oddziaływania elektrostatyczne, to jest wiązania wodorowe. Ze względu na budowę, cząsteczka wody może utworzyć aż cztery takie połączenia, z czego skwapliwie korzysta.
Tworzenie się takich oddziaływań między cząsteczkami wody, które w przeciętnych temperaturach mimo wszystko szybko się zrywają, na tyle "skleja" cząsteczki, że woda wykazuje anomalnie wysoką temperaturę wrzenia i krzepnięcia. W przypadku pozostałych niemetali obowiązuje prosta zasada - im lżejszy główny atom tym niższe są te graniczne temperatury. Siarczek wodoru, mający dwa razy cięższy atom centralny, jest już gazem o niskiej temperaturze wrzenia. Gdyby zasada obowiązywała do końca, woda byłaby gazem o temperaturze skraplania około -100 stopni.

Z faktu tworzenia takich wiązań wynika też kilka innych nietypowych własności, lecz szczegóły molekularne nie zostały jeszcze do końca poznane. Najnowsza publikacja dorzuca jedno ciekawe rozwiązanie, i zarazem nową zagadkę - otóż jak się okazuje pewne zachowania bardzo wyziębionej wody daje się wytłumaczyć przy założeniu, że tak na prawdę mamy do czynienia z mieszaniną dwóch różnych wód.

Oprócz kilkunastu odmian krystalicznych lodu, znamy też formy amorficzne, otrzymane przez bardzo szybkie schłodzenie wody, co nie pozwala cząsteczkom uporządkować się w kryształy. Zależnie od warunków przeprowadzenia procesu, można otrzymać dwie fazy szkliste różniące się gęstością, z różnym upakowaniem. Podczas badań przemian fazowych tych form stwierdzono, że podczas topnienia zamieniają się w ciecz, której właściwości zależą od tego z jakiej formy amorficznego lodu powstała.
Dla ciał szklistych, a więc nieuporządkowanych, nie ma właściwie klasycznego topnienia. Zwiększanie temperatury powoduje mięknięcie materiału następujące w pewnym przedziale, w wyniku którego najpierw otrzymuje się ciało bardzo plastyczne, mogące pod wpływem sił płynąć, a potem dopiero ciecz.
W przypadku amorficznego lodu stwierdzono, że na powierzchni ogrzewanych bryłek pojawia się faza płynna, mogąca występować w dwóch formach: wysokiej gęstości i niskiej gęstości. Fazy te są metastabilne w danych warunkach. Mowa o temperaturach rzędu 100 K czyli -170 C, znacznie poniżej temperatur zamarzania. W tak niskiej temperaturze powstająca ciecz pozostaje płynna, bo brakuje dodatkowej energii potrzebnej na uporządkowanie cząsteczek w krystaliczny lód.

Powstałe dwie fazy wody mogą przechodzić jedna w drugą ale istnieje pomiędzy nimi granica. W obserwowanym przypadku w cienkiej warstwie na powierzchni lodu szklistego istniały osobne domeny jednej z faz. Fazy różnią się gęstością i lepkością. Sądzi się, że może to wytłumaczyć niektóre nietypowe własności przechłodzonej wody - nieliniowa zmiana parametrów fizycznych to wynik powstawania wskutek fluktuacji obszarów zawierających w istocie dwie różne fazy ciekłe.[1]

Spirala hydratacyjna
Cząsteczki wody z powodu silnego momentu dipolowego zwykły otaczać rozpuszczane cząsteczki przylegającą powłoką hydratacyjną. Niedawne badania rentgenowskie cząsteczek DNA pokazały, że na łańcuchu powłoka ta przybiera ciekawą formę. Podstawowe domeny DNA to zasady purynowe, między którymi oddziaływania łączą nici, następnie cukier deoksyryboza i dalej reszta fosforanowa. Nici są skręcone w helisę, to jest formę przypominającą skręconą drabinę. Ponieważ cząstki deoksyrybozy są przestrzennie dość duże, w modelu DNA pojawiają się dwie szczeliny skręcone tak samo jak nici.

No i otóż jak stwierdzono, w wyniku hydratacji w tą szczelinę wchodzą cząsteczki wody tworząc spiralną strukturę, która podobnie jak samo DNA jest chiralna, ale zarazem na tyle trwałą że da się ją zaobserwować spektroskopowo.
Ma to o tyle znaczenie, że pewne leki (ale też toksyny) działają poprzez przyłączanie się do łańcucha DNA. Jeśli woda tworzy wyraźną strukturę w samym rowku helisy, to zbliżające się cząsteczki muszą ją wypychać. Uwzględniając ten efekt można zaprojektować cząsteczki łatwiej wpasowujące się w szczelinę.[2]

Oszacować czas zbrodni
Po opuszczeniu ciała, krew podlega różnego rodzaju przemianom chemicznym i fizycznym. Najpierw krzepnie i wysycha, następnie pod wpływem tlenu, światła i wilgoci pewne składniki mogą ulegać rozkładowi. Bardzo stara plama krwi może wyglądać jak złożona z brudu, mieć kolor brązowy, brudnożółty czy nawet zielonkawy. Jak niedawno odkryto powolne zachodzenie tego typu przemian można zbadać i na tej podstawie z całkiem niezłą dokładnością oszacować jak stara jest plama. Co z pewnością znajdzie zastosowanie w kryminalistyce.

Zastosowaną techniką była w tym przypadku spektroskopia Ramanowska. W tym typie bada się widmo światła rozproszonego przez próbkę. Jeśli oświetlimy ją światłem o pewnej konkretnej częstotliwości fali, w widmie światła rozproszonego pojawią się dodatkowe sygnały o innych częstotliwościach. Ich źródłem są drgające fragmenty cząsteczek, podlegające zmianom długości i położenia wiązań. W istocie technika ta bada podobne zjawiska jak w spektroskopii w podczerwieni.
Ze złożenia informacji o tym, że w badanej substancji znajdują się konkretne fragmenty dające konkretne przesunięte sygnały, można wywnioskować z czym mamy do czynienia.

W tym przypadku próbki krwi rozmazanej na powierzchniach poddano naturalnemu starzeniu przez okres do dwóch lat. Co pewien czas badano widmo próbek. W trakcie starzenia, pewne sygnały zanikały, zaś inne pojawiały się tam gdzie ich nie było, świadcząc o przemianach chemicznych w próbce. Na podstawie wielu porównań możliwe było określenie zmian w sygnałach pojawiających się już po upływie kilku godzin od pobrania krwi. Bazując na tak powstałej skali badacze byli w stanie określić przybliżony wiek plamy krwi z dokładnością do 70%. [3]
 http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2468170917300218

--------
[1]  Anders Nilsson et al. Diffusive dynamics during the high-to-low density transition in amorphous ice. PNAS, June 26, 2017 DOI: 10.1073/pnas.1705303114
[2]  1. M L McDermott, H Vanselous, S A Corcelli and P B Petersen, ACS Centr. Sci., 2017, DOI: 10.1021/acscentsci.7b00100
[3]  Kyle C. Doty, Claire K. Muro, Igor K. Lednev; Predicting the time of the crime: Bloodstain aging estimation for up to two years, Forensic Chemistry Volume 5, September 2017, Pages 1–7

poniedziałek, 12 marca 2012

Elektroforeza DNA

Mam w tym roku zajęcia z biochemii i oczywiście dokumentuję wykonywane ćwiczenia, a niektóre są bardzo ciekawe. Ostatnio przerabialiśmy elektroforezę. W zasadzie główne ćwiczenie dotyczyło elektroforezy białek na żelu PAG, ale to nie zbyt się nam udało. Równocześnie jednak prowadzący zajęcia postanowił pokazać nam coś ekstra a mianowicie elektroforezę DNA - a więc taki typ badania, z którego korzysta się na przykład przy ustalaniu ojcostwa.

Elektroforeza
to technika analityczna w dużej mierze zbliżona do chromatografii, w niektórych podręcznikach klasyfikowana jako jeden z jej działów. Zasadniczo główną zasadą rozdziału mieszanin jest tu skorzystanie ze zjawiska ruchu jonów w polu elektrycznym. Każda cząstka naładowana znalazłszy się w polu elektryczny zaczyna być przyciągana w kierunku elektrody o przeciwnym znaku. Aniony zbliżają się do dodatnio naładowanej anody a kationy do ujemnie naładowanej katody. Już to może stać się podstawą rozdziału prostych substancji, bardzo ładny przykład widać w tym filmiku, gdzie żółty anion chromianowy oddziela się od niebieskiego katjonu kompleksowego tetraaminamiedzi. Zasadnicza różnica między migracją jonów a elektroforezą jest ta, że w tym drugim przypadku wędrują duże cząsteczki naładowane, na przykład stałe cząstki koloidu, wielkomasowe białka albo takie cząsteczki jak kwas deoksyrybonukleinowy.
Sam ruch cząstek nie miał by wielkiego znaczenia dla analityki, gdyby nie fakt, że różne cząsteczki poruszają się z różną prędkością. W zasadzie szybkość ruchu jest tym większa, im większy niesie ładunek, i tym mniejsza im większa jest to cząsteczka. Pewne znaczenie ma też kształt oraz inne oddziaływania z ośrodkiem, którym może być roztwór lub specjalny żel, rzadziej bibuła.

Jak to ma się jednak do badania DNA? Przecież w każdej komórce jest jedna, taka sama cząsteczka, co tu więc do rozdzielania? Dobre pytanie. Biolodzy też długo nie mogli wpaść na to jak to zrobić, aż wreszcie ktoś odkrył enzymy restrykcyjne i wszystko stało się jasne.
Restryktazy to specyficzne enzymy wytwarzane przez bakterie i sinice, zapewne jako mechanizm obronny przed wirusami. Rozcinają one łańcuch DNA na obu niciach w miejscu w którym pojawia się specyficzna sekwencja zasad nukleinowych. Na przykład enzym EcoR I rozcina DNA w miejscu komplementarnych sekwencji GAATTC i CTTAAG, enzym Taq I w miejscu TCGA i AGCT, zaś Not I w miejscu GCGGCCGC i CGCCGGCG. Jak łatwo się domyśleć, ponieważ różne osoby mają różne geny, po rozcięciu ich DNA postanie nam mieszanina fragmentów i różnej długości i wielkości frakcji.

Powiedzmy że mamy łańcuch o zasadach: CCCAGAGGCCTTCTGGAGGAGTTGTTATCCTCGAAGACCACCGTTGACAGATT
i trzy enzymy, jeden rozcina łańcuch w miejscu AGA, drugi w GTTG a trzeci w TCCT.
Po zmieszaniu roztworu łańcucha z pierwszy otrzymamy mieszaninę fragmentów:
-ATT
-CCCAG
--ACCACCGTTGACAG
-AGGCCTTCTGGAGGAGTTATTGTCCTCGAAG

Z drugim:
-CCCAGAGGCCTTCTGGAGGAGT
-TGTTATCCTCGAAGACCACCGT
-TGACAGATT

Z trzecim:
-CCCAGAGGCCTTCTGGAGGAGTTGTTATC
-CTCGAAGACCACCGTTGACAGATT

Im dłuższy fragment tym wolniej będzie się poruszał a więc tym bliżej znajdzie się miejsca naniesienia. Jeśli więc weźmiemy naszą próbkę łańcucha, potraktujemy osobno trzema enzymami i naniesiemy na płytkę, to otrzymamy w przybliżeniu coś takiego:

Jeden enzym dał dwa długie fragmenty, drugi dwa długie i jeden krótki a trzeci cztery różnej długości. Jeśli dysponujemy długim łańcuchem i porozdzielamy go kilkoma lub kilkunastoma enzymami, otrzymamy na płytce wzór składający się z prążków o różnym przesunięciu i natężeniu, a liczba wszystkich możliwych kombinacji jest olbrzymia. W badaniach DNA zakłada się, że dla różnych ludzi wzór utrwalony na płytce będzie różny, stąd możliwość identyfikcji tożsamości lub pokrewieństwa.

W naszym pokazowym doświadczeniu procedurę mieliśmy już o tyle uproszczoną, że próbką badaną był wzorcowy roztwór pociętego DNA plazmidowego, pozostawało nam zatem przygotować płytkę i nanieść próbkę. Ten typ badania standardowo wykonuje się w żelu agarozowym. Agaroza to właściwy środek żelujący wyodrębniany z agaru naturalnego. Przygotowanie jest dosyć proste. Odważoną ilość agaru należało rozpuścić w gorącym roztworze zasadowego buforu, dodać odczynnika barwiącego kwasy nukleinowe i przelać do odpowiedniej kuwety, wkładając przed zatężeniem plastikowy "grzebień". Po zastygnięciu w miejscu grzebienia pozostają równe zagłębienia, stanowiące kuwetki na próbki:

Po oznaczeniu spektrofotometrycznie stężenia wzorca i po zmieszaniu go z roztworem barwnika należało pobrać go mikropitetą i wkroplić do zagłębień. Cała płytka była już wtedy zalana roztworem elektrolitu, dlatego nieco cięższy roztwór próbki należało bardzo ostrożnie umieścić w zagłębieniach, tak aby nie wypłynął - co nie było wcale takie łatwe. A potem należało włączyć prąd i poczekać. Jako że mamy tu do czynienia z kwasem organicznym, należy oczekiwać że w środowisku zasadowym na resztach fosforanowym pojawią się ładunki ujemne, a zatem cała cząsteczka będzie wędrowała ku dodatnio naładowanej anodzie.

DNA jest bezbarwne, jak więc ujawnić prążki frakcji? Zajął się tym dodany do żelu odczynnik, którym był w tym przypadku bromek etydyny, związek organiczny mającego skłonność do tworzenia trwałych kompleksów z DNA, wpasowując się pomiędzy nicie. W związku z tym przy pracy z nim należało zachować ostrożność, łatwo bowiem wchłania się przez skórę a z racji właściwości jest silnym mutagenem. Bromek ma też tą właściwość, że wyraźnie świeci w świetle ultrafioletowym. Dlatego po odczekaniu odpowiedniego czasu wyjęliśmy żel z płytki i w zaciemnionym pomieszczeniu podświetliliśmy ultrafioletem, ujawniając nieco może niewyraźne ale widoczne prążki frakcji.

Nie próbujcie tego w domu...