Ostatnio w laboratorium (70.)

Badanie zawartości fosforanów przy pomocy testu z błękitem molibdenowym:

   Na potrzeby chemików stworzono wiele prostych testów pewnych właściwości, ułatwiających im przygotowywanie odczynników i pomiar. Na przykład papierki wskaźnikowe różnego typu, od kwasowo-zasadowych, przez wykrywające utleniacze (papierki jodoskrobiowe), siarkowodór (papierki ołowiowe), czy nawet testy paskowe do wykrywania witamin, narkotyków albo hormonów, nieraz z całkiem przyzwoitą dokładnością.
   Przykładem mogą być gotowe zestawy w próbówkach, do oznaczeń kolorymetrycznych - próbkę dodaje się do próbówki, w której jest już odczynnik, do tego dodaje się inne, zakręca, miesza i wykonuje pomiar. Parę takich zestawów mieliśmy w laboratorium, jako dodatek do jednego ze spektrofotometrów, mającego w oprogramowaniu gotową metodę oznaczania, z wpisaną zależnością stężenia od nasycenia koloru, bez potrzeby tworzenia krzywej kalibracyjnej.
   Zestaw generalnie służył do badania wody lub ścieków, ewentualnie roztworów z niezbyt dużą ilością zanieczyszczeń organicznych. Sądziłem, że raczej zestaw się za bardzo nie przyda, najwyżej czasem zbadamy wodę używaną w zakładzie. Aż pojawił się problem.

   Należało w miarę szybko oznaczyć w pewnym surowcu roślinnym zawartość fosforu. Przepatrzyłem odczynniki. Soli baru, używanych do wytrącania i oznaczania fosforanów grawimetrycznie, nie było. Wzorce do ICP też nie miały tego niemetalu. Postanowiłem trochę zaimprowizować, i zastosować test na fosforany w wodzie, który w swoim składzie zawierał odczynnik molibdenianowy.
  Próbka została spalona w piecu elektrycznym do białego popiołu. Ten rozpuszczony w kwasie solnym. Po przesączeniu od frakcji popiołu nierozpuszczalnego w kwasie otrzymałem roztwór do badań.
  Test jest dość czuły ale ma pewien wąski zakres w którym daje miarodajne wyniki, należało więc rozcieńczyć. Pierwsze rozcieńczenie przesączu do 250 ml dało roztwór wciąż zbyt stężony. Rozcieńczenie go w stosunku 1:10 trochę poprawiło sytuację, ale nadal było to poza zakresem dokładnej oznaczalności. Dopiero kolejne rozcieńczenie dało roztwór, którego stężenie mieściło się w zakresie testu.

   Związkiem barwnym powstającym w tej reakcji, był błękit molibdenowy. dość ciekawy związek nieorganiczny, będący rozbudowanym anionem, tworzonym przez aniony molibdenianowe z jednym jonem innego pierwiastka. Musi to być anion tlenkowy o tetraedrycznym układzie tlenów wokół centralnego atomu, zwykle reakcję wywołuje jon ortofosforanowy, krzemianowy, arsenianowy V i germanianowy.
W roztworze wodnym aniony molibdenianu VI tworzą z dodatkowym jonem strukturę klatkową, w której człony molibdenianowe zamykają w sobie anion obcy. Powstaje tak zwana struktura Keggina.

Struktura Keggina dla fosforowolframianu

Jon ten jest jeszcze bezbarwny. Pod wpływem środków redukujących dodawanych do mieszaniny - może to być kwas askorbinowy lub chlorek cyny - następuje redukcja jednego lub dwóch atomów molibdenu na niższy stopień utlenienia, bez zmiany samej struktury jonu. W wyniku tego między atomami o różnym utlenieniu zachodzą przejścia elektronowe, skutkujące pochłanianiem światła i pojawianiem się koloru.

Reakcja ta może więc albo wykrywać aniony tworzące z molibdenianem barwny związek, albo przy użyciu roztworu gotowego anionu fosforomolibdenianowego wykrywać obecność i ilość związków redukujących. W niektórych przypadkach anion bywa używany jako reduktor, w syntezie organicznej czy przy farbowaniu tkanin. W takim zastosowaniu fosforomolibdenian amonu stanowi jeden z roztworów używanych w histologii przy trójkolorowym barwieniu Massona - tkanki traktuje się kolejno hematoksyliną żelazową, zabarwiającą na ciemno jądra komórkowe, fuksyna zabarwia różowo acydofilne elementy, w tym składniki cytoplazmy, komórki mięśniowe i kolagen. Fosforomolibdenian usuwa fuksynę z kolagenu, który jest ostatecznie zabarwiany błękitem anilinowym.

Podobny błękitny kolor daje analog wolframianowy.

Patolodzy ale z humorem (recenzja)

Recenzji książek jeszcze tu na blogu nie miałem. Ale tą akurat warto jest jak sądzę tutaj zaprezentować.

  O czym jest ta książka? W dużej mierze o tym jak bardzo źle może coś pójść w organizmie. I o tym jak to wykryć. Zawód patologa raczej częściej jest kojarzony z medycyną sądową, wykonywaniem autopsji, badaniem wagi narządów itp. - no, chyba że komuś myli się z patologiczną młodzieżą, która kradnie żarówki i sika na klatce. Natomiast osoby zajmujące się oglądaniem wycinków tkanki są chyba pospolicie uważane za tych samych laborantów od badania moczu i krwi. Już samo pokazanie na czym właściwie polega zawód i jak dużą niesie odpowiedzialność, jest jedną z lepszych stron książki.

  Każdy pobrany wycinek, czy to pochodzący z wyciętego z powodu choroby narządu, czy to pobrany przy diagnostycznej biopsji, musi zostać przez nich przebadany - spreparowany, zabarwiony odpowiednimi środkami i uważnie obejrzany pod kątem obecności anomalii, wskazujących na możliwą chorobę. Czasem więc trafiają się im ciekawostki, jakie trudno by było wykryć innymi sposobami.
  Dużo częściej jednak ich zajęcie sprowadza się do przeglądania kolejnych wyciętych znamion, guzków i polipów, i opisywania po raz kolejny, że to normalna tkanka, czasem ze zwłóknieniem, naciekiem zapalnym, czy też czasem z resztkami nieszczęśliwie zawędrowanej pomiędzy kiszki wykałaczki. Niestety też często muszą opisywać nowotwory różnego pochodzenia i stadiów, decydujące o dalszym losie anonimowego pacjenta.

  Technicznie rzecz biorąc, większość tekstów w książce to trochę obrobione i wygładzone językowo teksty z bloga "Patolodzy na klatce". Regularni czytelnicy nie będą więc treściami mocno zaskoczeni. Dla czytelnika, który z twórczością autorki zetknął się po raz pierwszy w księgarni, będzie to pozycja nietypowa - o przypadkach medycznych i ich zawikłanych przyczynach, ale napisana z dystansem i umiejętnie dozowanym humorem. Z bardzo żywymi ilustracjami - dla niektórych ilustracje części omawianych organów, guzów i torbieli mogą się okazać nie do przełknięcia. Cóż, książka opisująca dokładnie niektóre choroby musi się wdawać w rzeczy ociekające krwią, limfą i innymi płynami, nie do końca przyjemnymi w wyobrażeniu.
  Przykładowo jeśli ktoś posiada silnie rozwiniętą wyobraźnię i empatię, to przeczytanie rozdziału o wadach wrodzonych może być dla niego trudnym zadaniem.

  Autorka stara się w miarę możliwości jasno tłumaczyć mechanizmy chorobowe, ale bez pomijania naukowych nazw i pojęć. Język jaki stosuje, zaprawiony jest humorem ale ostrożnie dawkowanym, często bowiem mowa o stanach trudnych, związanych z chorobą i śmiercią. Świadczy o tym choćby podtytuł, będący nawiązaniem do Rodziny Poszepszyńskich:



  Książka zasadniczo podzielona jest na kilka części - pierwsza to artykuły na tematy nieco luźniejsze, na przykład o kobietach, które dały nazwisko jednostkom chorobowym, czy o obrazach mikroskopowych, które do złudzenia przypominają rzeczy i zjawiska z życia codziennego (rozdział "Pięćdziesiąt twarzy pępowiny, czyli pieska widzę w tym raku"). Druga poświęcona jest nowotworom, począwszy od tych najstarszych, notowanych w zapisie kopalnym, przez przypadki specyficznych chorób w historii, aż po współczesną diagnostykę oraz pewnie niepokojące objawy, jakie warto znać. Trzecia część skupia się na chorobach pasożytniczych i zakaźnych, w tym na omówieniu co takiego właściwie robi komórkom wirus HPV, że wywołuje nowotwory; czy na opisaniu chorób wywoływanych przez rozwijające się w organizmie glony.
  Czwarta część omawia przypadki patologii ciąży, wad wrodzonych oraz wad związanych z zapłodnieniem, które do pojawienia się jakiegokolwiek płodu nie doprowadzą. Ostatnia część omawia różne przypadłości, od celiakii, aż po kamicę we wszystkich możliwych miejscach.

Wady?
  Cóż, zastanawiałem się jak książkę odebrałby zupełny laik, który nie miał wcześniej okazji czytać bloga autorki, oraz niespecjalnie dużo pamięta z lekcji biologii. Może przydatny byłby w takiej sytuacji jakiś suplement, objaśniający formie rysunku czy wyraźnego zdjęcia komórkę i jej struktury; obawiam się bowiem, że powtarzające się uwagi o wyglądzie chromatyny czy cytoplazmy, mogą być dla niektórych za mało obrazowe.
  Z ilustracjami i obrazowością pojawia się niekiedy trochę problemów - pewna wspomniana w tekście mała sierotka jest w polskiej popkulturze na tyle mało znana, że bez googlania trudno się domyślić, jaki właściwie kształt miały upamiętnione w pewnym eponimie oczęta. Wiem oczywiście, że z ilustrowaniem pojęć można przesadzić w drugą stronę, więc to kwestia pewnego wyważenia.

  W kończącym książkę rozdziale "Po co komu sekcja zwłok?" zdziwiło mnie, że tak skupiono się na walorach poznawczych, edukacyjnych, prawnych czy związanych z ostateczną weryfikacją diagnoz, natomiast ledwie napomknięto na końcu o pierwszym powodzie jaki przyszedł mi do głowy - o możliwości wykrycia takiej przyczyny, jaka ma wpływ na jeszcze żyjących ludzi. W końcu odkrycie, że przyczyną tajemniczej choroby zmarłego było zatrucie metalami ciężkimi z wody, lub choroba genetyczna, z pewnością zainteresowałoby innych członków jego rodziny, z którymi może się jeszcze niezauważalnie dziać to samo.

  Z mojego punktu widzenia oceniając, chętnie dowiedziałbym się z książki czegoś więcej o technikach barwienia preparatów; jest rozdział o hematoksylinie i eozynie, a przecież jeszcze tyle różnych ciekawych kolorków się wykorzystuje, włącznie z kolorowymi czy świecącymi przeciwciałami. 

Ostatnio w laboratorium (69.)

Nigdzie się tak bardzo nie pobrudzisz, jak w dobrze wyposażonym laboratorium chemicznym. Zwłaszcza wtedy, gdy przydarzy ci się pracować z nieszczelną rękawiczką, jak to zdarzyło mi się ostatnio podczas pracy ze stężonym kwasem azotowym. Oczywiście szybko umyłem palec, na którym poczułem w pewnej chwili podejrzaną śliskość. Efekt: żółta plama na skórze, której już się nie dało zmyć.

W sumie nie pierwszyzna, ale jeszcze o tym na blogu nie pisałem.

Plama to wynik znanej z podręczników szkolnych reakcji ksantoproteinowej, często przedstawianej jako reakcja charakterystyczna dla białek, co nie jest zupełnie słuszne. Polega ona w zasadzie na nitrowaniu grup aromatycznych w niektórych aminokwasach poprzez podgrzewanie ze stężonym kwasem azotowym. Po zalkalizowaniu środowiska żółta plama staje się ciemnopomarańczowa.
.
Kilka spośród aminokwasów budujących białka, w tym te w naszym organizmie, zawiera aromatyczne grupy, to jest węglowodorowe pierścienie o odpowiednim układzie wiązań podwójnych. Ze względu na bliskość atomu azotu, a także często inne dodatkowe grupy, pierścień aromatyczny jest dość aktywny i stosunkowo łatwo ulega nitrowaniu. Dotyczy to w zasadzie tyrozyny i tryptofanu, o tym aby w takich warunkach reaktywna była Prolina nie znalazłem informacji. Pierścień fenylowy w Tyrozynie nitruje się głównie w pozycji meta:

Aminokwas fenyloalanina nie daje w tej reakcji zabarwienia, ze względu na to, że grupa fenylowa jest w nim nieaktywna. Od azotu dzieli ją dłuższy odcinek.
W przypadku białek obfitujących w aromatyczne aminokwasy, nitrowanie można doprowadzić do dość wysokiego poziomu. Jednym z niekiedy używanych typów amatorskich materiałów wybuchowych jest znitrowane mleko w proszku, zawierające głównie nitrokazeinę. [1]

Nitroaminokwasy mogą też powstawać w organizmie w wyniku metabolizmu. Jedną z odmian wolnych rodników, jakim bacznie przygląda się medycyna, są reaktywne formy azotu (RFA), wywodzące się zwykle od tlenku azotu II (NO) będącego wolnym rodnikiem. Jest on ważnym sygnalizatorem chemicznym, regulującym procesy zapalne i napięcie mięśni, i wytwarzanym przez specjalny enzym. Z drugiej jednak strony może on reagować z białkami i DNA, zaburzając ich funkcję. W organizmie szybko ulega przemianie do innych reaktywnych cząsteczek, jak dwutlenek azotu czy nadtlenoazotyn. W pewnych procesach chorobowych RFA są wytwarzane w nadmiernych ilościach, prowadząc do stanu stresu nitrozacyjnego.
Znitrowana tyrozyna, powstająca w takich reakcjach, mogłaby być wskaźnikiem natężenia tego procesu.[2]

Canary Girls

Reakcja podobna do ksantoproteinowej może też zachodzić w wyniku kontaktu z innymi reaktywnymi nitrozwiązkami. W okresie I wojny światowej w USA zwrócono uwagę na skutki przewlekłego narażenia na trotyl. U pracujących nad przerobem tego wybuchowego materiału robotnic rozwijało się przewlekłe, żółte zabarwienie skóry całego ciała. Zaczęto je przez to nazywać Kanarkowymi Dziewczynami. Bardziej groźny okazał się jednak wpływ trotylu na inne organy, często wywoływał uszkodzenie wątroby, niedokrwistość i powiększenie śledziony. U 400 pracownic pojawiła się żółtaczka związana z niewydolnością wątroby, która zabijała co czwartą. Niektóre z nich rodziły żółte dzieci.
Na szczęście po pewnym czasie od zaprzestaniu kontaktu z chemikaliami, kolor skóry zanikał.[3]

Ot takie dodatkowe ciekawostki na temat znanej i "nieciekawej" reakcji.
----------
[1]  https://www.aristatek.com/newsletter/0512December/TechSpeak.aspx
[2] https://www.pnas.org/content/101/12/4003
[3] https://en.m.wikipedia.org/wiki/Canary_Girls

Ostatnio w laboratorium (68.)

Do laboratorium analitycznego mogą czasem przychodzić dziwne próbki. Jak choćby ostatnio - przyniesiono nam próbkę osadu z bojlera, o uderzającym zielonym kolorze, z zapytaniem czy możemy zbadać jakie pierwiastki w tym są, bo coś takiego się wytrąca. Już pierwszy rzut oka sugerował miedź:

Ale oko nie spektroskop, należało to jakoś potwierdzić. Pierwsze badanie - reakcja z kwasem solnym. Osad powoli rozpuszczał się, wydzielając bąbelki gazu. Czyli w skład osadu raczej wchodził zwykły węglanowy kamień. Roztwór po rozpuszczeniu miał słaby, zielonkawo-niebieski kolor. Co jeszcze mogło tam siedzieć? Wprawdzie mamy na wyposażeniu ICP-OES, ale włączanie aparatu na jedną próbkę było bezsensowne, najwyżej dołożymy próbkę roztworzonego osadu do innych, gdy będzie więcej zamówień. Na szybko to ja mogłem zrobić tylko klasyczne analizy próbówkowe.

Przegrzebałem odczynniki, szukając czegoś specyficznego. Dimetyloglioksymu nie było, podobnie jak benzoinooksymu, rodanek amonu jeszcze nie doszedł, wreszcie zdecydowałem się na dwie reakcje. Do części roztworu dodałem wodorotlenku sodu - powstał jasnoniebieski osad, jaki raczej daje miedź. Do drugiej dodałem roztwór żelazocyjanku potasu (ściślej: odczynnik Carreza I), powstał brunatno-czerwony osad, charakterystyczny dla miedzi. Aha, czyli w sumie potwierdzone.

Zastanawiałem się jednak czy da się w tym jeszcze wykryć żelazo, które zdecydowanie częściej występuje w wodzie, podbarwiając kamień kotłowy na brązowo. Nie było widać aby osad wodorotlenku podbarwiał rdzawy wodorotlenek żelaza III. Obstawiałem, że żelazo może być ewentualnie związane w formie związków żelaza II o słabym, zielonkawym zabarwieniu, maskowanym przez miedź. Postanowiłem dodać do zlewki kilka kropel wody utlenionej. Żelazo się dzięki temu utleni, osad pociemnieje. Myślałem przy tym, że wodorotlenek miedzi nie zareaguje, bo aby utlenić miedź do jeszcze wyższych stopni utlenienia, to trzeba bardziej agresywnych warunków. A jednak zostałem zaskoczony - zawartość zlewki stała się intensywnie zielona:

No dobra, może to żelazo daje taki efekt. Żółty i niebieski dają zielony, widocznie żelaza jest w tym osadzie dużo. Zrobiłem ślepą próbę z siarczanem miedzi, ale wynik był podobny - wodorotlenek miedzi w reakcji z wodą utlenioną robił się zielony.
Wyjaśnienie wiąże się z powstawaniem związku, o jakim wcześniej nie czytałem - powstaje nadtlenek miedzi - CuO2. Jest to związek nietrwały, szybko zresztą zaobserwowałem stopniowe ciemnienie i brunatnienie osadu, zachodzące z wydzielaniem bąbelków tlenu; po upływie 30 minut w zlewce był już tylko drobny, czarny osad tlenku miedzi II CuO.
Charakter i struktura tego tlenku są dyskutowane - w pewnym warunkach daje się uzyskać związek o podobnej stechiometrii, mający charakter dwutlenku, z czterowartościową miedzią.[1] W tym przypadku przypuszczalnie jest to cykliczny nadtlenek jonowy, zawierający dwuanion O²⁻
₂  .
W strukturze wewnętrznej wysokotemperaturowych nadprzewodników z grupy miedzianów, daje się wyróżnić płaszczyzny tlenku o stosunku 1:2, w których następuje nadprzewodnictwo elektronowe.

Tymczasem następnego dnia zauważyłem, że w próbówce w której badałem reakcję na żelazocyjanki, roztwór nad osadem związków miedzi zabarwił się na niebiesko. Błękit pruski jest lepiej rozpuszczalny w wodzie od żelazocyjanku miedzi, zwłaszcza przy mocno niestechiometrycznym stosunku jonów, co świadczyło o tym, że kamień kotłowy jednak zawierał też trochę żelaza.

ps. Tak się złożyło, że to 300 wpis na tym blogu.
--------
[1]  https://pubs.acs.org/doi/10.1021/j150655a014