informacje



Pokazywanie postów oznaczonych etykietą bioanalityka. Pokaż wszystkie posty
Pokazywanie postów oznaczonych etykietą bioanalityka. Pokaż wszystkie posty

piątek, 5 stycznia 2018

Paramedycy kochają In Vitro

Wydawałoby się, że głównym problemem z medycyną alternatywną, naturalną czy niekonwencjonalną, jest ignorowanie osiągnięć nauki. Jednak przeglądając tego typu portale odnoszę często odmienne wrażenie. Ich problemem jest także powoływanie się na osiągnięcia naukowe. Tylko że źle zrozumiane.

Jedną z takich charakterystycznych sytuacji daje się zauważyć na portalach i blogach dietetycznych, zdrowotnych czy zielarskich, które co i rusz donoszą, że oto właśnie odkryto, że "x leczy raka/odchudza/odmładza/uinteligentnia" i przypadkiem właśnie to x można kupić jako suplement.
I jeżeli artykuły takie powołują się na jakieś prawdziwe badania (powoływanie się na zasadzie: rosyjscy naukowcy, nie podamy jacy, odkryli, nie podamy jak, że x leczy y, ale nie powiemy skąd to wiemy - się nie liczy) to zazwyczaj są to bardzo podstawowe badania, w których nie badano rzeczywistego wpływu na chorego pacjenta, tylko na jego kawałek. A konkretnie na preparat wyizolowanych komórek, umieszczonych w szklanym naczyniu i potraktowanych jakimś roztworem. Jako że zaś szkło zwie się po łacinie "vitrum", a naukowcy chętnie wszystko latynizują, badanie takie nazywa się eksperymentem in vitro*.

Badania na izolowanych komórkach stanowią jedną z najbardziej podstawowych technik biomedycznych, służących do zbadania wpływu biologicznego interesującej nas substancji. Jeśli działa ona poprzez wpływ na enzym, receptor czy jakąś część komórki, to efekty powinny być możliwe do zauważenia i zmierzenia już w tak bardzo uproszczonym modelu. W ten sposób testuje się na przykład efekty toksyczne czy mutagenne, sprawdza się aktywność substancji przeciwwirusowych czy selektywnych blokerów receptorów.
Ostatnio coraz częściej testami na komórkach, ich wyhodowanych warstwach czy fragmentach skóry pobranych od dawców zastępuje się testy kosmetyków na zwierzętach.  Są więc w nauce ważne, ale przy interpretacji wyników trzeba pamiętać, że jednak mimo wszystko dotyczą dość specyficznej sytuacji. Opierają się o uproszczony model działania na organizm, a modele takie zazwyczaj mają swoje ograniczenia.

Bierze więc nasz badacz preparat komórek chorobowo zmienionych, dzieli na wiele małych próbek i traktuje różnymi stężeniami badanej substancji, powiedzmy wyciągu z czosnku albo może pochodnej dinitrofluorenometoksybenzochinonu. Po inkubowaniu w kontrolowanych warunkach dodaje do próbek wskaźnik żywotności, aktywności metabolicznej czy innych parametrów komórkowych, po czym sprawdza ile komórek wykazuje sygnał, w jakim stopniu wskaźnik uległ przemianie czy wchłonięciu.[1],[2] I otrzymuje wynik, że w próbce umieszczonej w próbówce, w roztworze takim a takim, po potraktowaniu badaną substancją, N % komórek wykazało zmiany. I wszystko ładnie, tylko co z tego?
Droga do kandydata na lek - 1 Wybór technik pozwalających w uproszczonym modelu sprawdzić na jaki parametr biologiczny substancja ma działać; 2. Przesiewowe testy na płytce sprawdzające jakie substancje z danej grupy wykazują jakieś działanie na badany preparat; 3. Testy in vitro konkretnych substancji, sprawdzające mechanizm i siłę działania; 4. Testy in vivo na modelu zwierzęcym; 5 Mamy kandydata do testów klinicznych. 90% badanych substancji nie dochodzi do ostatniego etapu.

 Z tego typu doniesieniami z badań in vitro jest ten problem, że trudno je wprost przełożyć na działanie na żywy organizm. Zwykle polegają one na tym, że traktuje się wyciągami próbkę komórek i sprawdza różnice w pewnych subtelnych parametrach. Tylko, że nie można na takiej podstawie wyciągać zbyt szybkich wniosków. Jest to raczej wskazówka, że skoro w danym procesie w organizmie znaczenie ma pewien enzym, receptor czy szlak sygnałowy, a nasza substancja wpływa na ów enzym/receptor/szlak, to zadziała też na proces w organizmie, ale aby móc to z całą pewnością powiedzieć należałoby przetestować to na tymże organizmie całym i żywym. Wynik testu in vitro jest więc wskazówką co do tego co można dalej testować, a co nie ma potrzeby, odsiewając preparaty nieczynne od najbardziej obiecujących.
W ten sposób szybko sprawdza się setki substancji o potencjale czynności biologicznej i ich drobne chemiczne pochodne. Testuje się jeden po drugim różne modyfikacje znanych antybiotyków czy setki naturalnych alkaloidów izolowanych z egzotycznych roślin. Jest to jednak dopiero początek drogi, przed nami jeszcze wiele innych testów, mających upewniać, ze nie wypuszczamy na rynek bubla o wartości placebo. Jeśli dla jakiejś substancji mamy tylko i wyłącznie testy na preparatach komórkowych a nie kliniczne, wówczas nie jest to żaden dowód działania, tylko jak wspomniałem, wskazówka. W takiej sytuacji mówienie, że dana substancja już teraz, na pewno wykazuje działanie na człowieka stanowi nadużycie. A w najlepszym razie nadmiar entuzjazmu.

W dodatku warto pamiętać, że istnieje na prawdę bardzo dużo substancji, które stuprocentowo zabijają w próbówce komórki nawet najzłośliwszego nowotworu. Myślę że domowy wybielacz wystarczałby w zupełności, ewentualnie stężony roztwór soli, kwas siarkowy czy podgrzanie całej próbówki do wrzenia. Informacja sprowadzona wyłącznie do "x niszczy w próbówce komórki raka" jest poznawczo bezwartościowa, bez wiedzy czy przypadkiem równie źle nie działa na komórki zdrowe. Czy przypadkiem nie jest po prostu tak szkodliwa, że zabiłaby pacjenta lepiej niż choroba

  Niestety wielu miłośników medycyny alternatywnej (oraz dziennikarzy popularnych gazet) uprawia takie właśnie zbyt szybkie wnioskowanie, połączone z pompowaniem efektownych haseł. Eksperymenty mają mieć znaczenie już teraz, bez wdawania się w niuanse i prawdopodobieństwa. Wyniki badań należy od razu zamienić w gotową praktyczną poradę dla czytelnika. Odbywa się to na zasadzie: "Jak stwierdzili amerykańscy naukowcy, wyciąg z korzenia berberysu zmniejszał proliferancję komórek nowotworowych prostaty o 10% bardziej niż u zdrowych... A zatem herbatka z bererysu leczy raka i to na pewno lepiej niż chemioterapia! Musicie ją pić!".


Bo komórki to nie organizm
Głównym problemem w przenoszeniu badań na pojedynczych komórkach na działanie substancji na organizm, jest kwestia zmieniającej się ze skalą złożoności układu. Co innego komórki nowotworowe i może obok zdrowe w odpowiedniej zalewie, a co innego podanie równoważnej ilości do organizmu złożonego z dziesiątków typów komórek i tkanek prowadzących różne przemiany metaboliczne. To, że substancja na szalce nie wpływała istotnie na powiedzmy hepatocyty, nie oznacza że podobnie mało wrażliwe będą na nią neurony czy nefrocyty. Tymczasem często okazuje się, że to co ma leczyć chorobę w jednej części organizmu, wywołuje ją w innej. Jeśli zaś bilans zysków i strat pokaże, że korzyści zdrowotne nie są w stanie przeważyć skutków ubocznych, to taka substancja nie może stać się lekiem.

 Jeśli wyniki badań in vitro i na modelu zwierzęcym są obiecujące, przeprowadza się badania kliniczne I fazy, polegające na podawaniu różnych dawek zdrowym osobom i sprawdzaniu reakcji, zależności między dawką a stężeniem, szybkości eliminacji itp. I zwykle wychodzą na jaw efekty które wcześniej były trudno uchwytne, na przykład substancja wpływa na psychikę lub uczulająco albo po prostu na człowieka w całości działa inaczej niż się wydawało.
Właśnie na tym etapie wykłada się większość badanych substancji.

To co sprawdzało się w wyidealizowanym modelu komórkowym, okazuje się nieprzydatne lub niebezpieczne dla żywego organizmu. Co z tego, że na szalce kwas dichlorooctowy zabijał komórki raka, skoro podany pacjentom powodował paraliż uszkadzając nerwy? [3] Co z tego, że abryna wydawała się selektywnym środkiem wywołującym apoptozę, skoro podczas testów klinicznych od zatrucia nią zmarł uczestnik?

Podana substancja może też ulegać po drodze różnym przemianom metabolicznym i w ogóle nie docierać do miejsca w którym ma działać. Woda utleniona reaguje z katalazami obecnymi w osoczu i tkankach i nie rozchodzi się po organizmie. Chondroityna czy kolagen nie polepszają stanu stawów bo ulegają strawieniu. Lecytyna hydrolizuje w jelitach i nie dociera do mózgu gdzie rzekomo ma poprawiać pamięć. DMT i inne halucynogeny z tej grupy, zażyte samodzielnie nie wywołają żadnej ciekawej reakcji, z powodu rozkładania przez enzym monoaminooksygenazę.
Przykładowy test - żywe komórki zamieniają dodany wskaźnik w związek o barwie różowej. Stosując w kolejnych dołkach płytki coraz mniejsze stężenia badanych substancji, łatwo określić przy jakim najmniejszym stężeniu dana konkretna hamuje rozwój komórek. Stąd

Problem ilości
Odmienne działanie na organizm niż na pojedyncze komórki, jest częściowo pochodną bardziej ogólnego zjawiska - mianowicie warunki po podaniu substancji pacjentowi są też pod tym względem inne niż test in vitro, że problematyczne jest osiągnięcie w organizmie stężenia takiego jak w testach.

Zobaczmy na przykład jak wygląda doniesienie[4] reklamowane na alternatywnomedycznych portalach w formie "herbatka z mniszka zabija raka w 48 godzin". W badaniu porównywano wpływ wyciągu z korzeni na komórki czerniaka i komórki skóry zdrowe. Stwierdzono wystąpienie efektu (spadek wskaźnika żywotności komórki) o wielkości ponad 50% po czasie 48 godzin na komórkach rakowych linii A375 w stosunku do linii komórek zdrowych. Sukces? Być może, ale w badaniu na komórkach czerniaka z linii G361 (odporna na leczenie) wyciąg o tym samym stężeniu wykazywał działanie odwrotne - w porównaniu z komórkami zdrowymi przeżywały o 20-50% lepiej.
Dopiero użycie jeszcze większego stężenia pozwoliło na otrzymanie pozytywnych skutków.

Mogłoby to oznaczać, że na niektóre typy czerniaka (czerniak może być wywołany wieloma różnymi mutacjami) wyciąg wodny z mniszka działa kancerobójczo a na inne w zbyt małym stężeniu wręcz ochronnie. I weź tu zgadnij jaki typ spośród setek możliwych mutacji ma osoba której poleca się herbatkę.

Drugi problem to użyte stężenia. Efekt apoptyczny pojawiał się dla stężeń 2,5 mg/ml dla jednej linii komórek i 10 mg/ml dla drugiej linii, utrzymywanych w otoczeniu komórki przez 48 godzin. Stężenia dotyczą przy tym ilości użytego liofilizowanego ekstraktu wodnego, czyli ekstraktu który odparowano otrzymując suchy proszek, z którego sporządzano potem roztwory.
Stężenia 2,5 mg/ml i 10 mg/ml to 2,5g/l i 10 g/l. Takie stężenie powinny osiągnąć substancje z ekstraktu w płynie otaczającym komórki aby warunki były podobne jak w badaniu in vitro, w przypadku pacjenta będzie to krew. Ponieważ człowiek ma w organizmie 5 litrów krwi, powinien wchłonąć od 12 do 50 g suchej substancji ekstraktu. Ale, ale - wyciąg wodny z mniszka zawiera małą ilość substancji rozpuszczonych. Aby wchłonąć takie ilości suchych substancji ekstraktu, pacjent musiałby wypić kilkanaście litrów naparu otrzymanego z powiedzmy kilku kilogramów mniszka. I utrzymywać takie stężenie przez 48 godzin... O ile oczywiście substancje aktywne (nie wiadomo nawet jakie) wchłoną się dostatecznie dobrze, bo mogą mieć niską, kilkuprocentową wchłanialność. O ile nie rozłożą się w organizmie pod wpływem enzymów. O ile nie okaże się, że w tak dużym stężeniu wywołują groźne skutki uboczne, których nigdy dotąd nie obserwowano, bo nikomu nie udało się uzyskać ich 1% stężenia we krwi.

Jednak portale powołujące się na te doniesienia nie przejmują się szczegółami. Dla nich ważne jest tylko stwierdzenie, że herbatka ze znanego zioła "leczy raka w ciągu 48 godzin", mogą dzięki temu polecać czytelnikom aby sobie czasem popijali po szklance i mieli złudne przekonanie, że to ich przed czymś chroni. To tak jakby polecać na ból głowy 1/80 tabletki aspiryny.

Jeśli jednak już uda się nam podać odpowiednio dużą dawkę związku, może się okazać że jest on w takiej ilości generalnie toksyczny. Przykładem mogą być ekstrakty z zielonej herbaty - wiele jest badań wskazujących na prozdrowotne właściwości zawartych w niej polifenoli, są także badania in vitro pokazujące wpływ hamujący na wzrost komórek rakowych. Jednak efekt stawał się wyraźny przy stosunkowo dużych stężeniach, będących odpowiednikiem wypijania dziennie 2-3 litrów naparu. Na szczęście z pomocą przyszli nam farmaceuci, oferujący suchy ekstrakt z zielonej herbaty w kapsułkach, pozwalający dostarczyć organizmowi trudne do uzyskania w normalny sposób dawki.
I niestety okazuje się że w tych dużych ilościach ekstrakt z zielonej herbaty uszkadza wątrobę. Te same polifenole, które w mniejszych ilościach likwidują wolne rodniki, w większych zaburzają działanie mitochondriów w których działaniu rodniki powstawać muszą.[5]


Przyprawione komórki fałszują wyniki
Innym aspektem jest niedoskonałość samych metod badawczych. Prawdzie zmiany na wyizolowanych komórkach są łatwiejsze do opracowania, bo zbadać możemy od razu ich większą ilość i opisać wyniki ilościowo i statystycznie, ale w pewnych przypadkach charakter testowanej substancji może powodować błąd.
Jednym z najczęściej stosowanych sposobów określenia żywotności komórek, jest podanie wskaźnika, który zostaje w żywych komórkach zmetabolizowany do formy, która świeci w ultrafiolecie. Im słabiej więc będzie świecić zawiesina komórek, tym gorsza jest ich żywotność. Wystarczy potraktować szereg próbówek badaną substancją, zmierzyć stosunek intensywności świecenia do stężenia i mamy wynik.

Zastanówmy się jednak co takiego się stanie, gdy badana substancja przypadkiem dobrze pochłania ultrafiolet. Wciąż żyjące i dobrze się mające komórki, które ją wchłoną, będą świeciły słabiej, tak jakby brakło im trzy ćwierci do śmierci. Idźmy dalej - porównujemy wpływ tej substancji na komórki zdrowe i na chore, i te chore z pewnych powodów wchłaniają tej substancji więcej. Będą zatem świeciły wyraźnie słabiej od zdrowych, a nasze wyniki zostaną zafałszowane. Można temu przeciwdziałać uzupełniając badanie o drugą serię z innym wskaźnikiem, na przykład działającym odwrotnie (świecenie oznaką śmierci komórki). Bardzo duża różnica między wynikami z tych dwóch serii będzie wskazówką, że w eksperymencie tkwi błąd. Można też tak zaprojektować doświadczenie, aby ten efekt zminimalizować, na przykład stosując dalszą obróbkę zawiesin komórkowych, podczas której usuwamy badaną substancję a nie wpływamy na zmetabolizowaną formę wskaźnika, czy stosując taki zakres UV który nie jest pochłaniany.
Wszystko to mogłoby bardzo pomóc uzyskać poprawne wyniki, ale wymagałoby dodatkowych nakładów, oraz mogłoby sprawić, że bardzo obiecujące wyniki nie będą już tak zachwycające.

Przykładem takiej sytuacji są omawiane w zeszłorocznej analizie z Nature badania aktywności biologicznej kurkumy [6]. Jest to żółtopomarańczowy pigment, dobrze rozpuszczalny w tłuszczach, będący składnikiem przyprawy kurkumy oraz mieszanki curry. Od lat bardzo intensywnie bada się kurkuminę, która okazała się posiadać bardzo obiecujące właściwości przeciwnowotworowe, przeciwzapalne, neuroprotekcyjne czy przeciwwirusowe. Spora część z tych właściwości została stwierdzone w badaniach in vitro. Problem w tym, że lipofilna kurkuma osadza się w błonach komórek i zasłania ich wnętrze, oraz jest przypadkiem... substancją pochłaniającą ultrafiolet.

W przeglądzie badań kurkuminy autorzy stwierdzili, że duża część eksperymentów w ogóle nie brała tego czynnika przeszkadzającego pod uwagę; wykonano je tak, jakby barwna substancja o charakterze pigmentu była przezroczysta. Drugim problemem badań nad tą substancją, było użycie zanieczyszczonych preparatów. Jeśli jako "kurkuminę" użyto wyciągu z kłącza ostryżu, to w rzeczywistości badana substancja była mieszaniną dziesiątków związków. Kurkumina mogła fałszować wyniki także za sprawą własności chelatowania metali (np. nie odwracała skutków toksyczności metali ciężkich na komórki, tylko zmniejszała ich ilość w roztworze), aktywności redoks (utlenianie lub redukowanie wskaźników poza komórką), tworzenie agregatów a w pewnych warunkach rozkład na zupełnie inne substancje.
Wiadomo na przykład, że w warunkach lekko zasadowych, podobnych do odczynu krwi, kurkumina staje się niestabilna, co przyspiesza w temperaturach wyższych niż pokojowa; obserwowane efekty mogą więc wynikać z działania produktów rozkładu (a skoro tak, lepiej jako leki testować je właśnie) o trudnym do określenia stężeniu w czasie doświadczenia.
W stężeniach zbliżonych do używanych w doświadczeniach wykazuje skłonność do tworzenia agregatów z białkami i lipidami, które mogą naśladować selektywną inhibicję. Związek po prostu oblepiał komórkę, zamiast wybiórczo wiązać się z wybranymi białkami, biorącymi udział w procesie chorobowym. Gdy w testach badających siłę wiązania z enzymami, do kurkumy dodano nieaktywny biologicznie detergent zapobiegający tworzeniu agregatów, zmierzona aktywność związku spadała wyraźnie. Bez niego cząsteczki enzymu w roztworze zlepiały się przy udziale kurkuminy w białkowe kłębki.

W cytowanym badaniu przeciwdziałania formowania się włókien białek Tau, które odpowiadają za rozwój choroby Alzheimera, pierwszy test wydawał się bardzo obiecujący. Eksperyment oparty o badanie intensywności fluorescencji tioflawiny, gromadzącej się w złogach białkowych, wydawał się pokazywać, że kurkumina hamuje powstawanie włókien w bardzo małych stężeniach. Eksperyment używający techniki fluorescencji polaryzacyjnej pokazał jednak wynik odwrotny, kurkumina działała bardzo słabo. Później okazało się, że kurkumina pochłaniała światło w zakresie w którym świeciła tioflawina, czyli zasłaniała ją fizycznie, udając aktywność biologiczną.

Konkluzją autorów było stwierdzenie, że duża część badań mających wykazywać wysoką siłę leczniczą kurkuminy, została przeprowadzona w warunkach w których większą rolę zaczynają odgrywać czysto fizyczne właściwości związku, które fałszowały wyniki. Natomiast w badaniach dobrze przeprowadzonych, w których unikano tych niepożądanych efektów ubocznych, kurkumina okazywała się działać dość słabo. Nie skreśla to całkiem tego związku, są bowiem badania wskazujące, że w pewnych przypadkach ma on faktycznie pewne zastosowanie, pokazuje jednak, że ostatnia moda na polecanie tej przyprawy w charakterze panaceum na wszystko, ma w rzeczywistości bardzo kruche podstawy.

Zbliżone efekty zakłócające może wywoływać reserwatrol, polifenol występujący między innymi w czerwonym winie, o bardzo obiecujących właściwościach biologicznych. Jedną z technik badania intensywności metabolizmu w komórkach, jest oznaczanie ilości wytwarzanego ATP. Do preparatu z rozbitych na kawałki komórek dodaje się lucyferynę i enzym lucyferazę. Substratem reakcji jest ATP z cytoplazmy.
Jak wykazały badania, reserwatrol jest inhibitorem lucyferazy. Może więc sprawiać wrażenie, że zmniejszył ilość ATP w traktowanych nim komórkach, gdy tak na prawdę jedynie zahamował reakcję odczynnika.[7]

Samo in vitro nie wystarczy
Jak to już wspominałem, jeśli ktoś reklamujący gotowy preparat oferuje go chorym jako działający lek, a na poparcie ma tylko i wyłącznie wyniki testów in vitro, to oszukuje potrzebujących. Albo jest świadomym oszustem albo nie rozumie badań na które się powołuje.
Na takich właśnie dowodów opiera się duża część reklam cudownych leków, witamin czy używek, w ostatnim czasie widziałem dużo artykułów o medycznej marihuanie, w których dowodami były tylko takie badania. Weźmy choćby taki popularny w internecie artykuł [8] twierdzący, że działanie marihuany potwierdza aż 100 badań naukowych. Wśród zaprezentowanych linków znalazło się kilkanaście prac przeglądowych (czyli podsumowania innych, w tym cytowanych w artykule, prac, nie będące kolejnym badaniem), kilka prac w których nie badano wpływu zdrowotnego tylko farmakokinetykę (szybkość wydalania i metabolizmu) oraz prawie 80 prac w których badano wpływ różnych kannabioidów na linie komórkowe w próbówkach. (tak, przejrzałem wszystkie linki)
W sekcji na temat chłoniaka nie zacytowano żadnego badania dotyczącego marihuany, wszystkie cztery dotyczyły wpływu syntetycznego związku anandamidu, który jest agonistą receptorów kannaboidowych; znalazły się w tym zestawieniu  tylko z powodu nazwy receptora. W sekcji "nowotwory szyi i głowy" zacytowano badanie, które... w ogóle nie dotyczyło leczenia nowotworów; stwierdza się w nim jedynie, że z ankiet u pacjentów z nowymi diagnozami wynika większe ryzyko nowotworów u palących tytoń i pijących alkohol i brak zmiany ryzyka u palących trawkę. Między stwierdzeniem "x nie wpływa na nowotwory" a twierdzeniem "to badanie potwierdza, że x leczy nowotwory" jest potężna różnica.

I właśnie dlatego marni dziennikarze, sprzedawcy tabletek i paramedycy, tak gorąco kochają in vitro.
--------
* Natomiast  eksperymentach na żywych organizmach to "in vivo". Dla porządku wymyślono też określenie dla "eksperymentów" symulacyjnych na komputerach, czyli "in silica" jako że jak na razie mikroprocesory są oparte o półprzewodnikowy krzem. Zastanawia mnie jak w tej sytuacji określić eksperymenty myślowe - In mentis?

[1] Metody badania aktywności leków in vitro
[2] Techniki stosowane w badaniach toksyczności in vitro.

[3] https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/16476929
[4]  https://www.hindawi.com/journals/ecam/2011/129045/

[5] http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1742-7843.2004.pto_950407.x/full
[6]  http://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.jmedchem.6b00975

[7]  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17064666/

[8] https://motywatordietetyczny.pl/2016/05/ponad-100-badan-naukowych-potwierdza-marihuana-niszczy-raka/

czwartek, 14 sierpnia 2014

Kiedyś w laboratorium (42.)

Dawno, dawno temu za wieloma latami, uczyłem się bioanalizy i jednym z ćwiczeń było identyfikowanie szczepów bakterii przy pomocy szeregu podłóż różnicujących. Szereg w całości omówię kiedy indziej, natomiast teraz na szybko opowiem o jednym podłożu - agarze TSI czyli trójcukrowy żelazowy.

Jest to podłoże produkowane w formie słupkoskosu - próbówka w części napełniona w całym przekroju, jest to tzw. "słupek", a w części napełniona ukośnie:
Podłoże zawiera barwnik czerwień fenolową, siarczan żelaza, tiosiarczan sodu oraz cukry: laktozę, glukozę i sacharozę. Rozróżnianie bakterii opiera się na strasznie prostej zasadzie - czy bakteria metabolizuje cukry i które i czy przerabia tiosiarczany na siarczki.
Metabolizowanie cukrów powoduje powstanie kwaśnych metabolitów, pod wpływem których czerwień fenolowa robi się żółta. jeśli bakteria fermentuje glukozę, podłoże początkowo będzie żółte, lecz ulatnianie kwaśnych produktów ze skosu spowoduje, że będzie on czerwony a słupek zółty. Metabolizowanie laktozy daje żółte zabarwienie obu części
Jeśli bakteria metabolizuje tiosiarczan do siarkowodoru, zareaguje on z żelazem, dając czarny osad siarczku żelaza. W przypadku badanego szczepu wynik był następujący:
Zmieniona barwa słupka - zatem bakteria metabolizująca glukozę, zapewne enterobakteria. Czarny pierścień - zatem metabolizuje tiosiarczany. W tym przypadku była to salmonella, być może serotypu Typhi, już nie pamiętam.

A teraz na parę dni wyjeżdżam na zlot astronomiczny. Życzcie mi dobrej pogody.

środa, 16 lipca 2014

Barwienie bakterii metodą Grama

Dawno, dawno temu, kiedy jeszcze uczyłem się w technikum chemicznym, jednym z przedmiotów była bioanaliza, gdzie uczyliśmy się jak badać mocz, rozpoznawać pod mikroskopem różne limfocyty, albo badać zawartość cholesterolu w osoczu.
Jednym z ciekawszych ćwiczeń była hodowla bakterii z powietrza - sterylną płytkę z podłożem odkrywało się na określony czas w nieruchowym powietrzu pomieszczenia, zakrywało i wstawiało do inkubatora. Bakterie które znajdowały się w powietrzu osiadały na płytce i tworzyły kolonie - jedna bakteria tworzyła jedną kolonię. Zliczając ilość kolonii na powierzchni płytki i znając czas wystawienia płytki, można było policzyć stężenie bakterii w powietrzu - całkiem proste.

Jednak otrzymane bakterie dobrze jest też jakoś zidentyfikować. Oprócz opisanych już kiedyś metod hodowli na podłożu różnicującym, inną techniką jest barwienie metodą Grama. Badanie obejmuje kilka etapów, a wszystkie je sfotografowałem.

Zasadnicza różnica między typami bakterii jaką wykrywa się w tym badaniu, to grubość i przenikliwość ściany komórkowej - w jednym bakteriach jest cienka, w innych stosunkowo gruba. Ma to wpływ na ogólną fizjologię bakterii, zaś dla medycyny znaczenie ma różna wrażliwość na leki - zasadniczo bakterie o grubszej ścianie komórkowej są bardziej odporne, z powodu słabszego wchłaniania antybiotyku do wnętrza. Różna grubość ścian komórkowych wykrywana jest przez selektywne wybarwianie fioletem krystalicznym. W jaki sposób?

Na początek należy sobie wybrać jakąś kolonię z której będziemy robić rozmaz:

Ja akurat wybrałem sobie taką w której na kolonię żółtą naciekała biała, mając nadzieję że uda mi się złapać dwa różne typy. Masę kolonii pobierałem ezą, to jest pętelką z drutu z rączką. Tę jednak należało przedtem wyżarzyć, aby usunąć wszystkie inne bakterie:

Ponieważ kolonia miała postać stałej masy, najpierw nabrałem nieco soli fizjologicznej:

potem nieco kolonii:

i rozmazałem na płytce:
Rozmaz należało teraz wysuszyć i utrwalić, aby bakterie dobrze przylegały do podłoża. Dlatego po podsuszeniu w suszarce przeciągnęliśmy płytki nad płomykiem lampki spirytusowej, tak aby masa bakteryjna "przyschła" do płytki.
Wszystkie płytki należało teraz umieścić nad tacką, założyć rękawiczki i uważać na ubranie, bo można się było nieźle pobrudzić. Najpierw każda płytka została zalana roztworem fioletu krystalicznego:
Następnie czekaliśmy dwie minuty, po czym zlaliśmy barwnik do tacki:
Nie usuwając całej cieczy, zalewaliśmy płytki płynem Lugola - na powierzchni płynu powstawała błyszcząca warstewka, jak podejrzewam był to wydzielający się jod. Płyn dzięki temu błyszczał i opalizował, wyglądając jak odwłok złotego żuka:


Po około trzydziestu sekundach zlaliśmy ciecz i dokładnie przemyliśmy alkoholem:

A następnie wodą:
Na sam koniec zalaliśmy płytki roztworem fuksyny:
Pół minuty potem zlaliśmy ją do tacki, płytki przemyliśmy wodą i osuszyliśmy w suszarce. Tak zabarwione płytki nadawały się do badania mikroskopowego:

Co takiego następowało podczas wybarwiania? Gdy zalewaliśmy płytki roztworem fioletu krystalicznego, wnikał on do bakterii zabarwiając je wszystkie. Dodany potem roztwór jodu dodatkowo przyciemniał zabarwienie poprzez tworzenie kompleksów jodu z barwnikiem. Na tym etapie zabarwione były wszystkie.
Jednak gdy przemywaliśmy płytki alkoholem, zaznaczyła się różnica - łatwo wypłukiwał on barwnik z bakterii o cienkiej ściance, natomiast nie był w stanie odbarwić bakterii o ścianie grubej. W efekcie te pierwsze stawały się bezbarwne, zaś te drugie ciemnofioletowe. Gdy zalaliśmy płytki fuksyną, odbarwione bakterie o cienkiej ścianie zabarwiły się na różowo. Te o grubej także, ale mocniejszy kolor fioletu zagłuszał róż.
W efekcie bakterie o ściance cienkiej zabarwiły się na różowo a te o grubej na ciemno fioletowo. Rożróżnianie bakterii pod mikroskopem jest zatem bardzo łatwe - bakterie Gram+ są fioletowe a Gram- różowe.

Akurat mnie, jako chemika-estetę bardziej zainteresowały kryształy fuksyny, które wykrystalizowały na płytce. Tutaj pęk kryształów w otoczeniu bakterii gram-ujemnych (powiększenie ok. 400X):
A tutaj w otoczeniu gram-dodatnich (pow. ok. 600X):


I na koniec mieszanka dwóch różnych typów bakterii:


sobota, 26 kwietnia 2014

Plując do próbówki - test na enzymy śliny

Badanie enzymów śliny stanowiło jedno z ciekawszych ćwiczeń na bioanalizie, przynajmniej pod względem procedury przeprowadzenia.

Ślina stanowi wydzielinę gruczołów zlokalizowanych w jamie ustnej, głównie ślinianek dużych, zlokalizowanych przy uszach, pod językiem i w szczęce, oraz drobniejszych ślinianek rozsianych na powierzchni języka i policzków.
Stanowi skomplikowany roztwór zawierający sole mineralne, głównie wapń, magnez, sód i potas, aniony kwasów organicznych, głównie cytrynowego, fosforowego i węglowego, anion tiocyjanianowy i wiele innych. Czynnikiem zagęszczającym i zwiększającym lepkość są białka mucyny tworzące żele. Oprócz nich ślina zawiera też wiele enzymów i czynników odpornościowych, pełniących funkcję obronną. Lizozym, obecny też w łzach, niszczy błony komórek bakterii Gramm dodatnich. Laktoferyna wiąże ślady żelaza, potrzebnego do rozwoju wielu bakterii. Immunoglobuliny atakują bakterie i pierwotniaki. Laktoperoksydaza utlenia patogeny, pełniąc też rolę odkażającą w mleku.
Inne składniki ochraniają tkanki jamy ustnej i gardła - lekko zasadowy odczyn i obecność soli mineralnych hamuje wypłukiwanie wapnia ze szkliwa, czynniki wzrostu, białka przeciwzapalne i stymulujące przyspieszają gojenie się ran wewnątrz jamy ustnej - zwierzęta wiedzą co robią gdy wylizują sobie rany. Z drugiej strony są bakterie które jakoś sobie w tych warunkach radzą, o czym świadczą choćby problemy dentystyczne, wywoływane przez szczepy zakwaszające ślinę.

Co jednak równie ważne, ślina zawiera też enzymy trawienne, toteż żucie i mieszanie z nią pokarmu przed przełknięciem, jest pierwszym etapem trawienia. Ślinowa lipaza uaktywniana po przełknięciu w żołądku rozpoczyna trawienie tłuszczów, u noworodków które jeszcze nie zaczęły wytwarzać lipaz w trzustce, ta ze śliny jest jedyną dostępną. Rybonukleaza zaczyna trawić kwasy nukleinowe. Białko haptokoryna chroni witaminę B 12 przed rozkładem w żołądku. Tak więc jak widzicie, dobre przeżucie jedzenia to podstawa.
Dla mojego doświadczenia najistotniejsze były jednak enzymy trawiące wielocukry - ślinowa amylaza rozbija długie łańcuchy skrobi, dzieląc wiązania glikozydowe, i odczepiając cząsteczki maltozy, złożonej z dwóch cząsteczek glukozy. Drugi enzym maltaza rozbija go na glukozę, ale ma to już mniejsze znaczenie. Ogółem skrobia zostaje rozbita na dekstryny i maltozę, będąc trawioną w ok. 30%, reszta zostanie przerobiona przez amylazę trzustkową w jelitach


O aktywności amylazy możemy się niekiedy przekonać podczas długiego żucia chleba - zwykły, pozbawiony słodyczy chleb, po dłuższym przeżuciu staje się słodkawy, co czuć zwłaszcza przy przełykaniu - powstająca maltoza jest lekko słodka. Właściwości śliny są też używane do produkcji napojów alkoholowych - południowoamerykańska Chicha jest produkowana z przeżutej kukurydzy. Wypluwki mieszane są w cieple w dużym naczyniu, gdzie następuje rozkład skrobi. Dopiero do tego dodaje się zakwas z bakteriami, które wywołują fermentację proadząc to powstania niskoprocentowego napoju alkoholowego. Z kolei z przeżutego manioku Indianie wytwarzali masato, którego przygotowanie i spożywanie było obrządkiem plemiennym.

W jaki sposób można zbadać enzymy śliny? W naszym przypadku oparliśmy się na właściwościach amylazy do rozkładania skrobi. Skrobia jak wiadomo tworzy z jodem intensywnie granatowy kompleks, pozwalający wykryć skrobię lub jod. Jeśli enzym rozłoży skrobię na maltozę bądź krótkołańcuchowe dekstryny to zabarwienie pod wpływem jodu nie będzie się pojawiać. I tak oto przedstawia się cała idea badania. Ale najpierw trzeba zdobyć próbkę śliny.

W tym celu z grupy mającej zajęcia wybrano dwie osoby i tak się złożyło że byłem jedną z nich. Każdy dostał po próbówce i połówkę cytryny, aby jej zapach pobudzał wydzielanie śliny. Akurat w moim przypadku najzupełniej wystarczało samo wyobrażanie sobie zjadania cytryny. Należało zgromadzić kilka centymetrów śliny, tak aby starczyło na całą grupę.
Gdy już zebraliśmy wystarczającą objętość, ślina została rozcieńczona i przesączona.
Wcześniej przygotowaliśmy ok. 1% zawiesinę skrobi w wodzie. Rozdzieliliśmy ją na cztery próbówki, które zanurzyliśmy w łaźni wodnej nastawionej na 40 stopni, bo w tej temperaturze amylaza działa najszybciej i gdy już się ogrzały, do połowy dodaliśmy roztworu śliny a do drugiej połowy równą ilość czystej wody, otrzymując próbę kontrolną. Następnie próbówki ogrzewały się w łaźni przez pół godziny.
Gdy już minął przepisowy czas, do wszystkich czterech próbówek dodaliśmy kilka kropli płynu Lugola, zawierającego jod. Otrzymaliśmy następujący widok:




Zdjęcie trochę drgnięte, ale widać co trzeba - w połowie próbówek, w tych kontrolnych, zawartość zabarwiła się na granatowo. W tym z dodaną śliną stała się brązowa. Oznacza to że w próbie kontrolnej nie uległa zmianie skrobia, natomiast w tej ze śliną została rozłożona na nie dające reakcji barwnej fragmenty.
Zatem nasza ślina zawierała ten enzym.

Podobny enzym zawiera też ślina pszczół, a co za tym idzie również miód. Dzięki temu można zbadać, czy miód nie był klarowany przez podgrzewanie, bowiem amylaza ogrzana powyżej 45 stopni trwale traci swoje właściwości. Przebieg takiego badania jest bardzo podobny do badania śliny - próbkę miodu rozcieńcza się i miesza z zawiesiną skrobi. Całość utrzymuje się w cieple w około 35-40 stopni przez jedną lub kilka godzin, po czym sprawdza zabarwienia roztworem jodu. Brak zabarwienia świadczy o tym że miód zawiera aktywny enzym.
Szczegółowy przepis podawał Stobiński w książce "Chemia i Życie", którą zresztą polecam, dobry opis możecie znaleźć tutaj.
W przemyśle aktywność amylaz miodu określa się przy pomocy liczby diastazowej - jest to ilość mililitrów 1% zawiesiny skrobi, które jest w stanie w ciągu godziny zhydrolizować 1 gram miodu. Niska wartość świadczy o podgrzewaniu lub chrzczeniu syropem cukrowym.

niedziela, 2 czerwca 2013

Kiedyś w laboratorium (28.)

Witam po dłuższej przerwie.

Gdy jeszcze uczyłem się w technikum, jednym z przedmiotów była bioanaliza. Nauczyliśmy się wówczas wykonywania powstawowych badań bakteryjnych. Jedno z nich - z wykorzystaniem pozłoża Chapmana różnicującym bakterie mannitolo-dodatnie od mannitolo-ujemnych - już kiedyś opisywałem. Innym, które zaprezentuję dziś, było badanie z podłożem MacConkeya.
Jest to podłoże agarowe, zawierające laktozę, peptydy powstałe z hydrolizy białek, wskaźnik pH czerwień obojętną, i fiolet krystaliczny.
Podłoże Mac Conkaja z koloniami, od lewej - E. Coli, Salmonella, Proteus

Ten ostatni składnik hamuje wzrost bakterii Gram-dodatnich, jeśli więc badane bakterie nam na nim  wzrosną, możemy już powiedzieć, że są Gram-ujemne. Drugi składnik, będący wskaźnikiem kwasowości, wiąże się z drugą cechą rozróżnianą - zdolnością do trawienia laktozy. Jeśli bakterie mogą trawić laktozę, jak to w powyższym przypadku była w stanie robić kolonia E. Coli, to w wyniku metabolizmu będą zakwaszały podłoże. Czerwień obojętna w odczynie poniżej 6,8 staje się różowo-czerwona, dodatkowo zabarwiając same kolonie.
Jeśli bakterie nie trawią laktozy, to zużywają peptydy wydzielając amoniak, alkalizujący środowisko. W odczynie zasadowym czerwień obojętna jest lekko żółtawa i właściwie nie obserwujemy większych zmian barwy. Poniżej podaję jeszcze zbliżenie kolonii bakterii E. Coli:

czwartek, 19 lipca 2012

Kiedyś w laboratorium (13.)

Będąc jeszcze w technikum miałem krótko przedmiot bioanalitykę, gdzie między innymi omawialiśmy analizy mikrobiologiczne. Teraz więc przedstawię przykład jednego z takich badań, pozwalającego odróżnić odmiany gronkowców:
Podłoże Chapmana. Od lewej: czyste, gronkowce mannitol + i mannitol -

Podłoże Chapmana to pożywka składająca się z agaru, hydrolizatów białkowych, mannitolu, i czerwieni fenolowej, wobec stosunkowo wysokiego stężenia soli (rzędu 8-10%). Sól hamuje rozwój bakterii innych niż gronkowce Gram+, więc wzrost lub jego brak na tym podłożu jest próbą wykluczającą, natomiast użyte dodatkowe składniki mają wykrywać różnice między szczepami. Jeśli dany szczep może metabolizować mannitol - alkohol cukrowy otrzymywany z mannozy - to wytwarza kwaśne metabolity, które zakwaszają podłoże. Użyty wskaźnik czerwień fenolowa, będący sulfonową pochodną fenoloftaleiny, w warunkach obojętnych ma różowo-czerwony kolor, po zakwaszeniu poniżej pH 4,8 staje się żółta - szczepy dające tą reakcję określamy jako Mannitol +. Natomiast w przypadku szczepów nie mogących przetwarzać mannitolu (Mannitol - ) podłoże teoretycznie nie powinno zmienić barwy, jak jednak widać słabo malinowy kolor zamienił się w nieco chłodniejszy odcień purpury. Źródła do których zaglądałem nic o tym nie wspominają ale najwyraźniej jest to skutek metabolizowania aminokwasów z dodanych hydrolizatów, z których powstaje amoniak zwiększający pH podłoża.

Do bakterii mannitolo-dodatnich zalicza się Gronkowiec Złocisty, będący najczęstszą przyczyną groźnych infekcji. Bakterie tego typu uważa się zasadniczo za bardziej zjadliwe.