informacje



wtorek, 30 marca 2021

Kiedyś w laboratorium (83.)

 

Co to znaczy, że nasiona nadają się do siewu? Parametrów jakościowych nasion jest kilka - udział masowy zanieczyszczeń mineralnych, innych części roślin, ilość ziaren uszkodzonych itd. Ale najbardziej interesująca dla siejącego jest siła kiełkowania. Jest to po prostu odsetek ziaren które są zdolne do kiełkowania. Jeśli nasiona zebrano zbyt wcześnie, dojrzały w niesprzyjających warunkach lub były źle przechowywane, to nie będą kiełkować. 

Najprościej jest to sprawdzić wysiewając je i zliczając ilość kiełków. Tak też robiłem w pracy w Korycinach. Jednym z produktów były nasiona na kiełki, więc trzeba było sprawdzić czy się nadadzą. 

Odliczaliśmy więc po 100 nasion, i umieszczaliśmy na płytce Petriego wyłożonej mokrą watą. I tu uwaga dla chcących pobawić się w kiełkowanie - nasiona nie powinny pływać w wodzie. Do rozwoju zarodka potrzebne jest też powietrze. Inaczej jest spore ryzyko, że zgniją. Ziarna jest też dobrze przepłukać czystą wodą, żeby zmyć z nich bakterie i zarodniki pleśni.

Jako nasiono skiełkowane liczy się takie, które pękło i wysunęło wyraźnie kiełek poza okrywę. Jeśli nasiono tylko pękło i odsłoniło koniec zarodka ale nie wydłużył się on, to może być martwe. Niektóre nasiona w pierwszej kolejności wysuwają korzeń. 

Siła kiełkowania to procent nasion które wykiełkowały w ciągu kilku dni. My sprawdzaliśmy stan po 3 i 7 dniach. Trzymanie mokrych nasion dłużej było niewskazane - nasiona na kiełki powinny rosnąć szybko bo nikomu się nie chce czekać. Z kolei trzymanie płytki z częściowo wyrośniętymi dłużej, aby upewnić się czy pozostałe napewno nie zareagują, to prosta droga do kolonii pleśni. 

Niektóre gatunki roślin puszczają kiełki w ciemności, dlatego trzeba je namaczać w zamkniętej szafce.

 Różne gatunki mają opisaną różną wartość dopuszczalną siły kiełkowania, ale generalnie gdy spada ona poniżej 60% to takie nasiona nie bardzo się nadają do użytku.


wtorek, 23 lutego 2021

Kiedyś w laboratorium (82.)

 Jak pokazać reakcję Chemicznego Ogrodu bez szkła wodnego? Trzeba wysilić pamięć i przypomnieć sobie, w jakiej reakcji powstawały żelowate, zwięzłe osady. A nuż któryś będzie tworzył odpowiedniej jakości błonkę.


W takiej sytuacji znalazłem się w poprzedniej firmie, gdy przygotowywałem doświadczenia na pokaz chemiczny podczas dni otwartych. Byłoby fajnie to doświadczenie pokazać, ale brakowało podstawowego odczynnika. Znów więc należało uciec się do improwizacji. Najpierw próbowałem z żelazocyjankami, i wyszło bardzo dobrze. Potem postanowiłem poszukać czegoś jeszcze prostszego i przypomniałem sobie ze studiów, że odpowiedniej, galaretowatej konsystencji były osady niektórych wodorotlenków. Należało tylko wybrać takie, które nie rozpuszczały się w nadmiarze zasady.

Przygotowałem około 20% roztwór wodorotlenku sodu i najpierw wrzuciłem do niego kryształek soli niklu. Nic szczególnego się nie stało. Sól zaczęła się rozpuszczać, tworząc zielonkawą warstewkę. Cóż, nie jest to właściwy pierwiastek. Aby nie marnować roztworu do tej samej zlewki wrzuciłem kryształek chlorku żelaza. Wokół niego powstał rdzawy pęcherzyk. Który zaczął rosnąć i rosnąć. Wyglądało to lepiej niż się spodziewałem. Ostatecznie siła wzrostu rośliny przyhamowała, pęd zaczął się zaginać i grubieć w nieregularne gruzła. Ze względu na ciemnozielone tło skojarzył mi się z konikiem morskim; dlatego tę modyfikację pozwolę sobie nazwać Reakcją Żelaznego Konika.
 


Efekt tak grubego pędu powstaje przy wysokich stężeniach zasady. Roślinka wzrasta wtedy powoli i z wyraźnymi epizodami pękania błonki.Zarazem jednak przy małym krysztale wyrównanie gęstości następuje szybko, i dlatego z czasem pęd staje się za ciężki i zagina się pod powierzchnią.


 Reakcja w bardziej rozcieńczonym roztworze (5-10%) jest mniej efektowna. Wokół kryształka powstaje przylepiony do dna bąbel, z którego zaczynają wyrastać cienkie "wąsy". W ich formowaniu spory udział mają bąbelki powietrza, które przywarły do powierzchni bąbla. Wąs powstaje dość szybko, ale poza tym nic się z nim nie dzieje. 



środa, 20 stycznia 2021

Kiedyś w laboratorium (81.) - kolorymetryczne oznaczanie glutenu

 Gdy jeszcze pracowałem w laboratorium kontroli jakości w Korycinach, jednym z ważnych ale bardzo rzadko wykonywanych oznaczeń, było sprawdzanie obecności i stężenia glutenu w produktach, co do których producent chciał się chwalić, że są nisko/bezglutenowe.

Samo tylko branie surowców roślinnych, które glutenu w sobie nie zawierają, to jeszcze za mało, aby produkt można było w taki sposób oznaczać. Wystarczą zanieczyszczenia na linii produkcyjnej i kłopot gotowy. Słyszałem, że zdarzały się przypadki silnego zanieczyszczenia ziół pszenicą z powodu użycia do zbioru z pola kombajnu, wcześniej użytego do zbóż; dlatego zapewnienia dostawcy, że roślina nie rosła obok pszenicy trzeba brać ostrożnie. Podobny problem dotyczy przypraw - te sprowadzane z zagranicy już sproszkowane mogą być zanieczyszczone, choćby z powodu praktyki przesypywania niezmielonych części jakąś mączką aby się nie sklejały na pryzmie.

Wedle przepisów, za bezglutenowy podać można produkt zawierający mniej niż 20 ppm glutenu; to jest mniej niż 20 mg/kg. Granica jest więc mocno wyśrubowana i nietrudno o jej przekroczenie. Więc aby nie było problemów, skarg od klientów czy wycofywania partii, dobrze jest badać sprawę na miejscu.

W laboratorium używaliśmy testu immunochemicznego Elisa, z użyciem gotowych płytek z dołkami, odczytywanych przez specjalny skaner. Zawartość glutenu wpływała na natężenie koloru w dołku, było to zatem oznaczanie kolorymetryczne.

Płytka testowa. W górnym rzędzie próby ślepe i seria wzorców
Metodyka działania testów Elisa jest w większości przypadków podobna i opiera się o podobne mechanizmy co odporność organizmu i reakcja na patogeny. Organizm po wprowadzeniu do niego obcego białka, czyli antygenu, wytwarza rozpoznające je przeciwciała. Te po związaniu się z antygenem tworzą kompleks, który jest zjadany i unieszkodliwiany przez białe krwinki. Specyficzność wiązania przeciwciała z antygenem jest wysoka, stąd pomysł użycia do testów chemicznych.

Test używany w tym przypadku opierał się o technikę podwójnego wiązania. Dołki w płytce do testów zawierają żelowe podłoże, w którym związane zostały specyficzne przeciwciała anty-gluten. Po wprowadzeniu do dołu roztworu otrzymanego z próbki, obecny gluten wiąże się z przeciwciałami, tworząc jednostronny kompleks:

Płytka--[przeciwciało]----(gluten)

Roztwór jest teraz wylewany a dołek przepłukiwany buforem. Chodzi o usunięcie śladów niezwiązanego antygenu, aby nie przeszkadzał. Teraz dołek zawiera podłoże z unieruchomionym kompleksem, w którym gluten jest przyłączony na raz tylko z jednym przeciwciałem od jednej strony. Teraz dodajemy do dołka drugi roztwór, zawierający kolejne przeciwciała anty-gluten, ale tym razem połączone ze znacznikiem. Dla większej specyficzności powinny to być przeciwciała wiążące się z drugim końcem antygenu, niż te związane z podłożem. Obrazowo można by to wyjaśnić, że pierwsze wiążą się z sekwencją "glu" a drugie z sekwencją "ten".

Drugie przeciwciała zawierają połączony z nimi jakiś enzym, który posłuży do uwidocznienia. Może to być peroksydaza chrzanowa, która utlenia pewne związki pod wpływem wody utlenionej, albo jakaś fosfataza. Powstaje teraz kompleks dwustronny, z przeciwciałem obklejonym antygenami z dwóch stron:

Płytka---[przeciwciało]----(gluten)----[przeciwciało]---enzym

Cały ten długi łańcuch służy więc w istocie temu, aby przytwierdzić do podłoża enzym końcowy. Po kolejnym przepłukaniu dołka zalewa się go w końcu właściwym substratem. Jest to jakiś związek, który w warunkach roztworu jest przemieniany enzymem w inną substancję o wyraźnym zabarwieniu. Substrat ma w roztworze pewne określone stężenie. Enzym ma w buforze aktywność, to jest "moc przerobową" wywołania reakcji określonej ilości cząsteczek w jednostce czasu, dlatego reakcja powinna trwać przez konkretny czas, przewidziany przez producenta. Reakcję przerywa się następnie roztworem kończącym i w tym momencie intensywność zabarwienia, czyli po prostu stężenie produktu barwnego, zależy od stężenia antygenu w próbce. W moim przypadku substratem była zapewne tatrametylobenzydyna, która utleniona peroksydazą zamienia się w niebieski barwnik. 


 

Roztwór kończący to kwas siarkowy, który uniemożliwia dalsze utlenianie substratu i zmienia jego kolor na żółty. Podobna reakcja utlenienia benzydyny, katalizowana przez hemoglobinę, bywa czasem używana do kryminalistycznego wykrywania śladów krwi.

Jak łatwo się domyśleć, jeśli w roztworze nie ma antygenu, to całe te łańcuchy kompleksów się nie tworzą,  dodane na sam koniec przeciwciała z enzymem nie zostają związane i wypłukuje je płukanie dołka. Z kolei w razie obecności antygenu ilość cząsteczek enzymu związanego na samym końcu zależy od ilości cząsteczek antygenu w początkowym roztworze, co przy standaryzowanym stężeniu substratu i określonym czasie trwania reakcji doprowadza do stężenia końcowego produktu barwnego zależnego dokładnie od stężenia antygenu w próbce. Czyli w tym przypadku od ilości glutenu. Czułość testu była dostatecznie duża, aby wykryć śladowe ilości glutenu w próbkach zawierających go nawet kilka razy mniej niż ustawowe 20 ppm.

Sama procedura analityczna nie jest skomplikowana, ale może być nieco uciążliwa i czasochłonna. Próbki zmielić oddzielnie lub przy pomocy młynka przepłukiwanego dokładnie po każdej innej próbce. Roztwory na dołki nakłada się pipetą automatyczną na określony czas, co może sprawiać problemy przy dużej ilości próbek. Pamiętam jak raz użyliśmy całej jednej płytki (45 próbek po 2 razy). Nie mieliśmy na stanie pipety z rzędem wielu końcówek, więc aby wyrobić się z dodawaniem odczynników do wszystkich dołków w przepisowym czasie, pipetowaliśmy na cztery ręce, bo inaczej zanim by się z jedną pipetą doszło do 96 dołka, to z pierwszego już trzeba wylewać. Cała procedura to "wlej do dołka roztwór 1 i poczekaj X minut, wylej, dodaj roztwór 2 i odczekaj x minut; wylej, dodaj bufor, wylej, powtórz płukanie, wylej, dodaj roztwór 4 itd. itp.".

Odczynniki mają ograniczoną trwałość i muszą być przechowywane w zamrażarce, i w zasadzie to one są najdroższe w całym tym oznaczaniu.